d**********9
发帖数: 981 | 1 一个质粒上只有两个酶切位点NheI和AscI，但是我要连接两个不同来源的PCR产物，酶
切后一段含NheI和BamHI,另一段含BamHI和AscI,可不可以直接将3段连接？有什么办法
可以提高效率？请求高手帮忙，多谢多谢！ |
p*****e
发帖数: 93 | 2 可以先放到两个载体上， 再从上面切下来做三段连， 比直接做三段连效率高些。
【在 d**********9 的大作中提到】
: 一个质粒上只有两个酶切位点NheI和AscI，但是我要连接两个不同来源的PCR产物，酶
: 切后一段含NheI和BamHI,另一段含BamHI和AscI,可不可以直接将3段连接？有什么办法
: 可以提高效率？请求高手帮忙，多谢多谢！
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w*e
发帖数: 740 | 3 直接把三个扔在一起，把载体 (最长的那个）
的量相对少一半（减少载体自连），运气只要不太差的话，一下子就成了；
【在 d**********9 的大作中提到】
: 一个质粒上只有两个酶切位点NheI和AscI，但是我要连接两个不同来源的PCR产物，酶
: 切后一段含NheI和BamHI,另一段含BamHI和AscI,可不可以直接将3段连接？有什么办法
: 可以提高效率？请求高手帮忙，多谢多谢！
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s******s
发帖数: 13035 | 4 四个base互补，问题不大
【在 d**********9 的大作中提到】
: 一个质粒上只有两个酶切位点NheI和AscI，但是我要连接两个不同来源的PCR产物，酶
: 切后一段含NheI和BamHI,另一段含BamHI和AscI,可不可以直接将3段连接？有什么办法
: 可以提高效率？请求高手帮忙，多谢多谢！
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H*******i
发帖数: 196 | 5 直接连就行了，PCR产物要保证没有小的杂带可以提高效率 |
s*****i
发帖数: 315 | 6 一般情况下PCR产物切胶回收比直接purify要好得多，也避免了这种杂带的问题
个人经验可以考虑直接三段连，但是不如从质粒上切下来效率高。
可以适当延长PCR产物的酶切时间，因为酶切不完全是导致三段连法连接失败的主要原因
【在 H*******i 的大作中提到】
: 直接连就行了，PCR产物要保证没有小的杂带可以提高效率
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s********n
发帖数: 2939 | 7 直接连没问题，做个colony PCR screen一下就可 |
