n****0
发帖数: 696 | 1 为什么单酶切产物比未酶切的质粒对照跑的快呢？双酶切倒是得到了想要的大小的产物
。谢谢。 |
w*e
发帖数: 740 | 2 未酶切的因为是环状，所以没直线的单酶切跑的快，和结构有关吧
【在 n****0 的大作中提到】
: 为什么单酶切产物比未酶切的质粒对照跑的快呢？双酶切倒是得到了想要的大小的产物
: 。谢谢。
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g*****n
发帖数: 250 | |
z*******6
发帖数: 679 | 4 确实，我也觉得明显说反了啊... 超螺旋的未酶切质粒跑的比线性化的质粒快...
还有就是maxi-prep做的不好的时候，跑胶会看到两条带，一条超螺旋的跑得快的带，
另外一条应该是没有超螺旋的（这个我不太确定）... |
y*******i
发帖数: 42 | 5 我没有一次max prep的环状质粒不是2条带的，晕。难道我一次也没提好过？？？
【在 z*******6 的大作中提到】
: 确实，我也觉得明显说反了啊... 超螺旋的未酶切质粒跑的比线性化的质粒快...
: 还有就是maxi-prep做的不好的时候，跑胶会看到两条带，一条超螺旋的跑得快的带，
: 另外一条应该是没有超螺旋的（这个我不太确定）...
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n****0
发帖数: 696 | 6 是啊，按说是环状没被切跑的快啊，我以前做的也是这样的。可是这次我的结果是有一
条非常非常浅的线状大小的条带（可能质粒没提好断开了），还有一条或多条（有点
smear的感觉）跑的很慢的带，但是没有超螺旋那条带（应该跑的比线性的快才对），
这怎么回事呢？我只是做个酶切确定下自己的构建，双酶切倒是也有我的那个大小的片
段。不知道碍不碍事啊？之前subcloning的时候已经sequence过了，再克隆到donor
vector时就不用再sequence了吧？
【在 z*******6 的大作中提到】
: 确实，我也觉得明显说反了啊... 超螺旋的未酶切质粒跑的比线性化的质粒快...
: 还有就是maxi-prep做的不好的时候，跑胶会看到两条带，一条超螺旋的跑得快的带，
: 另外一条应该是没有超螺旋的（这个我不太确定）...
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z*******6
发帖数: 679 | 7 你没看清我说的啊... 我说做的不好或者有时候用国产kit的话...会看到两条带... 说
明你prep的好啊...
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【在 y*******i 的大作中提到】
: 我没有一次max prep的环状质粒不是2条带的，晕。难道我一次也没提好过？？？
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z*******6
发帖数: 679 | 8 为啥不贴张图上来看看。。。感觉就是miniprep没做好吧，我没做好的时候就是smear
。。。以前我都会从新做一次就好了。。。
保险起见都会sequence，主要是现在sequence太方面，要是以前手动测序这种情况就不
用sequence了。。。
所以我觉得我会从新做质粒，仅个人建议，以前我做克隆的时候经常会遇到诡异的问题
，但是绝大部分重做一次就没事了。。。我总觉得分子和微生物学方面很多东西其实我
们现在根本不明白是怎么回事，只知道简单的使用。。。
【在 n****0 的大作中提到】
: 是啊，按说是环状没被切跑的快啊，我以前做的也是这样的。可是这次我的结果是有一
: 条非常非常浅的线状大小的条带（可能质粒没提好断开了），还有一条或多条（有点
: smear的感觉）跑的很慢的带，但是没有超螺旋那条带（应该跑的比线性的快才对），
: 这怎么回事呢？我只是做个酶切确定下自己的构建，双酶切倒是也有我的那个大小的片
: 段。不知道碍不碍事啊？之前subcloning的时候已经sequence过了，再克隆到donor
: vector时就不用再sequence了吧？
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n****0
发帖数: 696 | 9 如图，lane1是marker，lane 2 3 6 7 是单酶切，lane 4 8 是双酶切，lane 5 9是没
有酶切的对照。我提了两个质粒，是一样的。
另外我的其中一个单酶切好像不完全，也有一个很大的带。难道我的质粒结合了什么别
的东西？
smear
【在 z*******6 的大作中提到】
: 为啥不贴张图上来看看。。。感觉就是miniprep没做好吧，我没做好的时候就是smear
: 。。。以前我都会从新做一次就好了。。。
: 保险起见都会sequence，主要是现在sequence太方面，要是以前手动测序这种情况就不
: 用sequence了。。。
: 所以我觉得我会从新做质粒，仅个人建议，以前我做克隆的时候经常会遇到诡异的问题
: ，但是绝大部分重做一次就没事了。。。我总觉得分子和微生物学方面很多东西其实我
: 们现在根本不明白是怎么回事，只知道简单的使用。。。
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g*r
发帖数: 2116 | 10 感觉你的质粒提的不纯 估计有蛋白污染 吸的时候是不是黏糊糊的感觉？
测个OD看看吧
【在 n****0 的大作中提到】
: 如图，lane1是marker，lane 2 3 6 7 是单酶切，lane 4 8 是双酶切，lane 5 9是没
: 有酶切的对照。我提了两个质粒，是一样的。
: 另外我的其中一个单酶切好像不完全，也有一个很大的带。难道我的质粒结合了什么别
: 的东西？
:
: smear
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n****0
发帖数: 696 | 11 260/280 大概1.9，260/230=2.1-2.2之间，这种纯度行么？
【在 g*r 的大作中提到】
: 感觉你的质粒提的不纯 估计有蛋白污染 吸的时候是不是黏糊糊的感觉？
: 测个OD看看吧
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g*****n
发帖数: 250 | 12 你如果用Qiagen kit提的，不可能有蛋白污染。倒可能，你上柱的样太浓，带来细菌
DNA污染，影响电泳游动。从图上看，更大的可能性是质粒nicked。 |
s******s
发帖数: 13035 | 13 你phenol抽一下。
btw，还有个可能是你的质粒复制的时候喜欢环套环，变成二聚三聚一类的，
所以看着大了
【在 n****0 的大作中提到】
: 如图，lane1是marker，lane 2 3 6 7 是单酶切，lane 4 8 是双酶切，lane 5 9是没
: 有酶切的对照。我提了两个质粒，是一样的。
: 另外我的其中一个单酶切好像不完全，也有一个很大的带。难道我的质粒结合了什么别
: 的东西？
:
: smear
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g*r
发帖数: 2116 | 14 会不会是这个情况？
Multimers are concatemers/fused products of several plasmids recombined
together. Happens naturally if plasmids are cultivated in recA+ strains of
bacteria. These plasmids are several times as large as the individual
plasmid and therefore run very slowly in agarose (regardless of their
conformation).
【在 n****0 的大作中提到】
: 260/280 大概1.9，260/230=2.1-2.2之间，这种纯度行么？
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n****0
发帖数: 696 | 15 质粒nicked是什么意思？
【在 g*****n 的大作中提到】
: 你如果用Qiagen kit提的，不可能有蛋白污染。倒可能，你上柱的样太浓，带来细菌
: DNA污染，影响电泳游动。从图上看，更大的可能性是质粒nicked。
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n****0
发帖数: 696 | 16 谢谢大家的回复，看起来可能是fusion、套环之类的原因 |
s******s
发帖数: 13035 | 17 peng一个
of
【在 g*r 的大作中提到】
: 会不会是这个情况？
: Multimers are concatemers/fused products of several plasmids recombined
: together. Happens naturally if plasmids are cultivated in recA+ strains of
: bacteria. These plasmids are several times as large as the individual
: plasmid and therefore run very slowly in agarose (regardless of their
: conformation).
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