s*****g
发帖数: 731 | 1 不太懂免疫，被committee强拉着要求做adoptive transfer实验。
我的问题是：
我给balb/c打自己做的流感疫苗（dose足够高,能完全保护lethal challenge)，然后
day28取serum，transfer 100 ul serum到naive balb/c. 等24小时，challenge 5*
LD50 wild type virus.通过眼睛下面的i.v注射，注射体积100ul.但都是没有保护作用
。请问可能出问题的原因是什么啊。
我同时还尝试做了cell transfer。day28取spleenocytes,transfer 20 million
spleenocytes，24h后用5*LD50 wild type virus打老鼠 intra venous，但还是没有保
护作用。请问可能的原因是什么啊。非常谢谢。 |
n**********7
发帖数: 29 | 2 你是想看什么的保护作用？测的endpoint是什么？
流感病毒一般引起CD8+ T 细胞的反应：cytotoxicity 或者生成IFN-gamma。
为什么要等28天？28天的时候一般大部分effector CD8+ T 都凋亡了，剩下的是memory
细胞，而且serum里的cytokine浓度应该也很小了，因为infection已经清除了。一般要
引起老鼠对疫苗的反应，好像应该注射三次，一次primary，然后每隔7天注射两次
booster，这样得到的antigen－specific细胞会多一些。
老鼠的splenocyte中大概只有12％是CD8+ T 细胞，并且只有antigen－specific的细胞
会对你注射的病毒起反应，所以看不到保护作用吧。
抗体也会对病毒抗原有反应吧，不过我对b细胞不太了解。
希望能帮到你。 |
O***n
发帖数: 13127 | 3 我给balb/c打自己做的流感疫苗（dose足够高,能完全保护lethal challenge)，
Which route did you use for challenge for this experiment?
day28取serum，transfer 100 ul serum到naive balb/c. 等24小时，challenge 5*
Same dose as previous Challenge? i guess the dose is too high for i.v.
infection. Also the dose is too high, so you cannot see protection if the
serum is not enough or T cells are not enough. you better do a titration of
the virus doses for challenge |
O***n
发帖数: 13127 | 4 what are you talking about?
...
memory
【在 n**********7 的大作中提到】
: 你是想看什么的保护作用？测的endpoint是什么？
: 流感病毒一般引起CD8+ T 细胞的反应：cytotoxicity 或者生成IFN-gamma。
: 为什么要等28天？28天的时候一般大部分effector CD8+ T 都凋亡了，剩下的是memory
: 细胞，而且serum里的cytokine浓度应该也很小了，因为infection已经清除了。一般要
: 引起老鼠对疫苗的反应，好像应该注射三次，一次primary，然后每隔7天注射两次
: booster，这样得到的antigen－specific细胞会多一些。
: 老鼠的splenocyte中大概只有12％是CD8+ T 细胞，并且只有antigen－specific的细胞
: 会对你注射的病毒起反应，所以看不到保护作用吧。
: 抗体也会对病毒抗原有反应吧，不过我对b细胞不太了解。
: 希望能帮到你。
|
n**********7
发帖数: 29 | 5 immunology.
we use influenza virus vaccination as antigen to generate antigen-specific T
cells. and adoptive transfer these T cells to wild-type mice to measure
immune response.
Maybe I understand the questions in a wrong way
【在 O***n 的大作中提到】
: what are you talking about?
: ...
:
: memory
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s*****g
发帖数: 731 | 6 非常感谢各位回答。因为发完贴就回国了，然后签证悲剧的被check了很久，所以没法
上来看贴。
我之前的问题写的不太清楚。
我有一株疫苗，这株疫苗本身的PD50（半保护剂量）是10 PFU。所以1.0e+4 PFU的注射
量，能提供完全的保护作用，可以抗击1000 LD50的野毒challenge （通常challenge是
在接种疫苗后第28天进行）。
所以，committee想知道我们的疫苗为什么能起到保护作用。他们让我做adoptive
transfer。我就尝试了2次。按常规方法，给balb/c male老鼠通过鼻腔接种1.0e+4 PFU
疫苗，在第28天时取serum，把100ul serum在同一天通过眼底静脉打到naive mice里，
24小时后，通过鼻腔注射challenge 5*LD50 的野毒。
按照道理，应该能提供保护，但老鼠都死了。
我又按同样的做法做了一遍，但这次transfer的不是serum，而是2e+7 spleenocytes，
24小时后，仍旧通过鼻腔注射challenge 5*LD50 的野毒。同样的，老鼠全死了。
所以很奇怪一点，同样是在疫苗接种28天后，为什么serum和spleenocytes都不提供保
护。
nongnong1987提到memory细胞，因为之前打疫苗然后challenge，在28天时老鼠没有任
何问题，所以理论上serum里的剩余的抗体，跟spleen里的memory细胞都应该有保护作
用。committee建议我用接种后28天的老鼠来做transfer donor，也是希望effector T
都没了，只剩下memory细胞，然后重新memory细胞被transfer后能重新expand，并且提
供保护。
本意是先把whole spleenocytes都转了，然后删除B细胞，或者删除T细胞，看看哪一种
细胞真正的提供了保护作用。但现在试了2次，连第一步whole spleenocytes都没有保
护作用，所以有点茫然。
非常谢谢各位的意见。 |
p**t
发帖数: 160 | 7 How to measure antigen-specific T cells？ Tetramer？
T
【在 n**********7 的大作中提到】
: immunology.
: we use influenza virus vaccination as antigen to generate antigen-specific T
: cells. and adoptive transfer these T cells to wild-type mice to measure
: immune response.
: Maybe I understand the questions in a wrong way
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s****e
发帖数: 5429 | 8 Maybe the titration is not enough. For serum transfer, I would try another
experiment to infect the mice as soon as the transfer is done (just in case
that the serum is diluted and degraded in the body and not provides
protection). For cell transfer, my wild guess is that not enough specific
cells were transferred. I would try to get cells from draining LN for the
experiments (cervical LNs in this case?). Hope this may help.
PFU
【在 s*****g 的大作中提到】
: 非常感谢各位回答。因为发完贴就回国了，然后签证悲剧的被check了很久，所以没法
: 上来看贴。
: 我之前的问题写的不太清楚。
: 我有一株疫苗，这株疫苗本身的PD50（半保护剂量）是10 PFU。所以1.0e+4 PFU的注射
: 量，能提供完全的保护作用，可以抗击1000 LD50的野毒challenge （通常challenge是
: 在接种疫苗后第28天进行）。
: 所以，committee想知道我们的疫苗为什么能起到保护作用。他们让我做adoptive
: transfer。我就尝试了2次。按常规方法，给balb/c male老鼠通过鼻腔接种1.0e+4 PFU
: 疫苗，在第28天时取serum，把100ul serum在同一天通过眼底静脉打到naive mice里，
: 24小时后，通过鼻腔注射challenge 5*LD50 的野毒。
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s****e
发帖数: 5429 | 9 That is my guess too. not enough cells.
memory
【在 n**********7 的大作中提到】
: 你是想看什么的保护作用？测的endpoint是什么？
: 流感病毒一般引起CD8+ T 细胞的反应：cytotoxicity 或者生成IFN-gamma。
: 为什么要等28天？28天的时候一般大部分effector CD8+ T 都凋亡了，剩下的是memory
: 细胞，而且serum里的cytokine浓度应该也很小了，因为infection已经清除了。一般要
: 引起老鼠对疫苗的反应，好像应该注射三次，一次primary，然后每隔7天注射两次
: booster，这样得到的antigen－specific细胞会多一些。
: 老鼠的splenocyte中大概只有12％是CD8+ T 细胞，并且只有antigen－specific的细胞
: 会对你注射的病毒起反应，所以看不到保护作用吧。
: 抗体也会对病毒抗原有反应吧，不过我对b细胞不太了解。
: 希望能帮到你。
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s*****g
发帖数: 731 | 10 非常感谢，
我会试试这两个办法。
case
【在 s****e 的大作中提到】
: Maybe the titration is not enough. For serum transfer, I would try another
: experiment to infect the mice as soon as the transfer is done (just in case
: that the serum is diluted and degraded in the body and not provides
: protection). For cell transfer, my wild guess is that not enough specific
: cells were transferred. I would try to get cells from draining LN for the
: experiments (cervical LNs in this case?). Hope this may help.
:
: PFU
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