j*******a
发帖数: 236 | 1 有两个跨膜区，不可溶，大量存在内涵体中。问题在于，把蛋白分离出来很容易，产量
很高，电泳后蛋白大小正常，与理论值相符。
可是：
1. 和cobalt 或者镍resin混合后，混合物中出现很多块状物（聚集在一起，RESIN很难
沉下来，与溶液清晰分层）
2. 过柱子后，蛋白莫名其妙就消失了，看到的那些带比理论值小很多。比如，理论值
90kDa，那些小带只有40左右。
同时我们纯化去掉跨膜区的同一个蛋白，一点问题都没有。 |
b******n
发帖数: 4225 | 2 有没有取一些柱介质跟2X loading buffer混合之后跑电泳
如果在柱介质中看到大量目的蛋白，说明你的蛋白可能堵在柱子里面了
elution buffer需要添加高浓度蛋白变性剂才能elute下来
40kd的小带可能是molecular chaperone DnaJ
【在 j*******a 的大作中提到】
: 有两个跨膜区，不可溶，大量存在内涵体中。问题在于，把蛋白分离出来很容易，产量
: 很高，电泳后蛋白大小正常，与理论值相符。
: 可是：
: 1. 和cobalt 或者镍resin混合后，混合物中出现很多块状物（聚集在一起，RESIN很难
: 沉下来，与溶液清晰分层）
: 2. 过柱子后，蛋白莫名其妙就消失了，看到的那些带比理论值小很多。比如，理论值
: 90kDa，那些小带只有40左右。
: 同时我们纯化去掉跨膜区的同一个蛋白，一点问题都没有。
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j*******a
发帖数: 236 | 3 谢谢回复和建议。正在跑电泳检查。不过根据前几次实验，感觉蛋白和RESIN结合的那
步有问题---蛋白和resin一混合就有块状物形成。
【在 b******n 的大作中提到】
: 有没有取一些柱介质跟2X loading buffer混合之后跑电泳
: 如果在柱介质中看到大量目的蛋白，说明你的蛋白可能堵在柱子里面了
: elution buffer需要添加高浓度蛋白变性剂才能elute下来
: 40kd的小带可能是molecular chaperone DnaJ
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t*****2
发帖数: 213 | 4 看了你的描述，可能说明你的包涵体裂解的有问题。 不知道你用什么变性，尿素还是
盐酸胍？浓度多少？
【在 j*******a 的大作中提到】
: 有两个跨膜区，不可溶，大量存在内涵体中。问题在于，把蛋白分离出来很容易，产量
: 很高，电泳后蛋白大小正常，与理论值相符。
: 可是：
: 1. 和cobalt 或者镍resin混合后，混合物中出现很多块状物（聚集在一起，RESIN很难
: 沉下来，与溶液清晰分层）
: 2. 过柱子后，蛋白莫名其妙就消失了，看到的那些带比理论值小很多。比如，理论值
: 90kDa，那些小带只有40左右。
: 同时我们纯化去掉跨膜区的同一个蛋白，一点问题都没有。
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A****w
发帖数: 244 | 5 为什么不先把resin装个小柱子，然后把你的样品load上去，这样样品干净多了，也没
有你的块状问题...... |
i*****g
发帖数: 11893 | 6 这些东西有什么好问的
Ni beads, Qiagen protocol explained everything
try 8M urea purification and elution |
p*****u
发帖数: 276 | 7 看情况可能是你那蛋白aggregation，试buffer吧。我之前也碰到过这问题，试了3个月
buffer才找到一个可以让蛋白稳定的。 |
