e********r
发帖数: 147 | 1 最近用32P同位素标记的ATP做激酶活性，过程里需要将反应里的ATP完全除去，但保留
被磷酸化的蛋白。ATP需要除得非常干净，避免使后面加的蛋白磷酸化，同时又要除得
快，避免前面被磷酸化蛋白半衰期短。曾经试过用10K的超滤膜多换几次洗涤液，但做
下来要1个多小时，还是嫌时间太长。有熟悉的朋友请介绍介绍，谢谢！ |
s******y
发帖数: 28562 | 2 How big is your protein? If bigger than 30kD you can use
mini desalting column with sephadex G-25. Done in less than 5 minutes.
If smaller than 30kD you can use sephadex G-10, or smaller.
【在 e********r 的大作中提到】
: 最近用32P同位素标记的ATP做激酶活性，过程里需要将反应里的ATP完全除去，但保留
: 被磷酸化的蛋白。ATP需要除得非常干净，避免使后面加的蛋白磷酸化，同时又要除得
: 快，避免前面被磷酸化蛋白半衰期短。曾经试过用10K的超滤膜多换几次洗涤液，但做
: 下来要1个多小时，还是嫌时间太长。有熟悉的朋友请介绍介绍，谢谢！
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k******0
发帖数: 1073 | 3 加入F1-ATPase或其它ATPase，将ATP快速消耗掉。
没有做过，只是建议。 |
k******0
发帖数: 1073 | 4 试试vivapure spin column离子交换柱。
基本上象质粒抽提，上样离心，蛋白质结合，其它（包括ATP）通过，加高盐洗脱蛋白
质。5min搞定。
很好用的柱子。我用于浓缩蛋白质长晶体。 |
C*******e
发帖数: 4348 | 5 谢一个
回收率大概多少
高盐洗脱以后不是还得透析才能拿去做screen
【在 k******0 的大作中提到】
: 试试vivapure spin column离子交换柱。
: 基本上象质粒抽提，上样离心，蛋白质结合，其它（包括ATP）通过，加高盐洗脱蛋白
: 质。5min搞定。
: 很好用的柱子。我用于浓缩蛋白质长晶体。
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k******0
发帖数: 1073 | 6 比如你用50uL高盐（3－500 mM）洗脱，用低盐稀释3－5倍就行了。
回收率还是很高的，95％以上吧。不过我的蛋白质浓度很高的。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢一个
: 回收率大概多少
: 高盐洗脱以后不是还得透析才能拿去做screen
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s******y
发帖数: 28562 | 7 可是这个如果是离子交换柱，应该和具体的蛋白的PI值有关系吧？
会不会限制于只能用于碱性蛋白什么的？不然的话ATP也会结合上去啊。
还是莫非其实是一个疏水结合柱？
【在 k******0 的大作中提到】
: 试试vivapure spin column离子交换柱。
: 基本上象质粒抽提，上样离心，蛋白质结合，其它（包括ATP）通过，加高盐洗脱蛋白
: 质。5min搞定。
: 很好用的柱子。我用于浓缩蛋白质长晶体。
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k******0
发帖数: 1073 | 8 有阴离子交换，阳离子交换。
其实和蛋白质PI关系不大，主要看蛋白质的表面带电。蛋白质如果够大， 如大的复合
体，阴阳离子交换柱都会结合。可能是就有带正电的表面和带负电的表面。小分子结合
的很弱。要不，你就可以用离子交换柱去除ATP了。
在pH8，好像我的大部分蛋白质都不同程度地结合Q柱上。
【在 s******y 的大作中提到】
: 可是这个如果是离子交换柱，应该和具体的蛋白的PI值有关系吧？
: 会不会限制于只能用于碱性蛋白什么的？不然的话ATP也会结合上去啊。
: 还是莫非其实是一个疏水结合柱？
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s******y
发帖数: 28562 | 9 恩，有一定道理。不过我想楼主在这么用之前最好先用少量蛋白试验一下，
看看到底能不能结合上去。
【在 k******0 的大作中提到】
: 有阴离子交换，阳离子交换。
: 其实和蛋白质PI关系不大，主要看蛋白质的表面带电。蛋白质如果够大， 如大的复合
: 体，阴阳离子交换柱都会结合。可能是就有带正电的表面和带负电的表面。小分子结合
: 的很弱。要不，你就可以用离子交换柱去除ATP了。
: 在pH8，好像我的大部分蛋白质都不同程度地结合Q柱上。
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C*******e
发帖数: 4348 | 10 如果浓度已经很高了
为什么还要用这个柱子啊
另外已经浓缩了
再用低盐稀释
不是又稀了么。。。。。。
你说的很高是多少？
10 mg/ml？30？50？100？
【在 k******0 的大作中提到】
: 比如你用50uL高盐（3－500 mM）洗脱，用低盐稀释3－5倍就行了。
: 回收率还是很高的，95％以上吧。不过我的蛋白质浓度很高的。
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s******y
发帖数: 28562 | 11 他是做结晶的，蛋白每次一提肯定都是一大堆的那种。
用这个柱子是为了除掉一些影响结晶的东西吧。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 如果浓度已经很高了
: 为什么还要用这个柱子啊
: 另外已经浓缩了
: 再用低盐稀释
: 不是又稀了么。。。。。。
: 你说的很高是多少？
: 10 mg/ml？30？50？100？
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c********b
发帖数: 363 | 12 麻烦能详细给个item number吗？我很感兴趣，去网站一查发现有好多不同品种，不是
很懂，希望能有详细的产品信息。
非常感谢。
【在 k******0 的大作中提到】
: 试试vivapure spin column离子交换柱。
: 基本上象质粒抽提，上样离心，蛋白质结合，其它（包括ATP）通过，加高盐洗脱蛋白
: 质。5min搞定。
: 很好用的柱子。我用于浓缩蛋白质长晶体。
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k******0
发帖数: 1073 | 13 对。
最后凝胶过滤纯化膜蛋白复合体，样品稀释了，需要浓缩但不能用膜浓缩，因为膜会浓
缩detergent影响复合体的稳定性。而且结晶，需要知道确定的溶液组分，如果走离子
梯度，就不知道多少盐在里面。
【在 s******y 的大作中提到】
: 他是做结晶的，蛋白每次一提肯定都是一大堆的那种。
: 用这个柱子是为了除掉一些影响结晶的东西吧。
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s******y
发帖数: 28562 | 14 我也很感兴趣！同求
【在 c********b 的大作中提到】
: 麻烦能详细给个item number吗？我很感兴趣，去网站一查发现有好多不同品种，不是
: 很懂，希望能有详细的产品信息。
: 非常感谢。
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s******s
发帖数: 13035 | 15 直接用millipore的filtration column, 完全物理size filtration，和
binding没关系。
http://www.millipore.com/catalogue/module/c82301
有不同size cutoff，也有不同的volumn (比如15ml, 4ml）
【在 e********r 的大作中提到】
: 最近用32P同位素标记的ATP做激酶活性，过程里需要将反应里的ATP完全除去，但保留
: 被磷酸化的蛋白。ATP需要除得非常干净，避免使后面加的蛋白磷酸化，同时又要除得
: 快，避免前面被磷酸化蛋白半衰期短。曾经试过用10K的超滤膜多换几次洗涤液，但做
: 下来要1个多小时，还是嫌时间太长。有熟悉的朋友请介绍介绍，谢谢！
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s******s
发帖数: 13035 | 16 btw, 这个做DNA特别方便，蛋白也可以，不过最好实验一下会不会bind上离不下来
【在 s******s 的大作中提到】
: 直接用millipore的filtration column, 完全物理size filtration，和
: binding没关系。
: http://www.millipore.com/catalogue/module/c82301
: 有不同size cutoff，也有不同的volumn (比如15ml, 4ml）
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k******0
发帖数: 1073 | 17 FDP-895-050L Spin column Vivapure Q mini M ion exchange FDP-895-055B
Spin column Vivapure Q mini H ion exchange Vivascience
我喜欢用Q（阴离子）而不是S（阳离子），在生理pH大部分蛋白质都会结合。只有Q不
结合的蛋白使用S。
我用大柱，如果少量样品，用mini M的就行了。
其实有各种各样的柱子，如Ni，输水，亲和，各种色谱柱都有。根据需要挑选了。
【在 c********b 的大作中提到】
: 麻烦能详细给个item number吗？我很感兴趣，去网站一查发现有好多不同品种，不是
: 很懂，希望能有详细的产品信息。
: 非常感谢。
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b******y
发帖数: 627 | 18 For LZ,
sunnyday's desalting method is the best to try. I will be surprised if it
doesn't work. I guess you have to use a syringe because nobody likes to
inject 32P into their FPLC. In that case, you should be careful of the
fraction size. Don't mix two well separated peaks during fractionation.
kaka1000's vivapure spin column离子交换柱 is a cation/anion exchange column,
to which unlimited volume can be loaded. In the end, elute with B buffer.
The peak is sharp because the salt concentration is high and all protein
will rush out. Theoretically, it can concentrate the target protein a lot
folds. Therefore, it is a great method for concentrating small stuff (e.g. a
peptide) that can't be concentrated easily. |
c********b
发帖数: 363 | 19 你不知道，有的蛋白虽然size在30KDa以上，但是fold成杆状，10KDa的都能出来，我试
过手上的这个蛋白，control没有降解，但是蛋白就是渗透出来，不过是size column还
是透析。用太小的size column或者透析的话又不能去掉Triton X100.
【在 s******s 的大作中提到】
: 直接用millipore的filtration column, 完全物理size filtration，和
: binding没关系。
: http://www.millipore.com/catalogue/module/c82301
: 有不同size cutoff，也有不同的volumn (比如15ml, 4ml）
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s******s
发帖数: 13035 | 20 那是有可能。所以我说做dna这个很棒，做蛋白有时候会有问题
【在 c********b 的大作中提到】
: 你不知道，有的蛋白虽然size在30KDa以上，但是fold成杆状，10KDa的都能出来，我试
: 过手上的这个蛋白，control没有降解，但是蛋白就是渗透出来，不过是size column还
: 是透析。用太小的size column或者透析的话又不能去掉Triton X100.
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s******y
发帖数: 28562 | 21 恩，我的蛋白也有这个问题，以前研究生院的老板说得蛋白分子量比标定的大
三倍才能用。
【在 c********b 的大作中提到】
: 你不知道，有的蛋白虽然size在30KDa以上，但是fold成杆状，10KDa的都能出来，我试
: 过手上的这个蛋白，control没有降解，但是蛋白就是渗透出来，不过是size column还
: 是透析。用太小的size column或者透析的话又不能去掉Triton X100.
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C*******e
发帖数: 4348 | 22 你说的“浓缩但不能用膜浓缩”指什么膜啊？
纯讨论
我也做结晶
不过是半路出家
所以很想知道不长晶体的时候除了蛋白本身以外是不是还有什么地方自己做的不对
我跟16楼shakuras一样
一直用的centricon和amicon
就是纯化完了以后透析，透析完了然后上centricon
溶液组分都是知道的
【在 k******0 的大作中提到】
: 对。
: 最后凝胶过滤纯化膜蛋白复合体，样品稀释了，需要浓缩但不能用膜浓缩，因为膜会浓
: 缩detergent影响复合体的稳定性。而且结晶，需要知道确定的溶液组分，如果走离子
: 梯度，就不知道多少盐在里面。
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C*******e
发帖数: 4348 | 23 +1
同有问题
【在 s******y 的大作中提到】
: 恩，我的蛋白也有这个问题，以前研究生院的老板说得蛋白分子量比标定的大
: 三倍才能用。
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l**********1
发帖数: 5204 | 24 Pls try
roche spin column protein
Quick Spin Protein Columns Sephadex G-25, fine
Catalog # Pack size Qty Price
03117936001 20 columns $116.00
//www.roche-applied-science.com/proddata/gpip/0_0_0_0_0_185.html
original hint is from:
[合集] 熟悉P32标记的大侠请进来帮个忙（重贴）
[版面:生物学][首篇作者：demoner] , 2009年01月21日
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31220531.html
【在 e********r 的大作中提到】
: 最近用32P同位素标记的ATP做激酶活性，过程里需要将反应里的ATP完全除去，但保留
: 被磷酸化的蛋白。ATP需要除得非常干净，避免使后面加的蛋白磷酸化，同时又要除得
: 快，避免前面被磷酸化蛋白半衰期短。曾经试过用10K的超滤膜多换几次洗涤液，但做
: 下来要1个多小时，还是嫌时间太长。有熟悉的朋友请介绍介绍，谢谢！
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s******y
发帖数: 28562 | 25 我猜他的意思是有些蛋白提纯的时候会有detergent 带进来，而detergent 本身
因为会形成那种小团状micelle（我为了写那个字都老羞成怒了，不小心就会
被改成michelle），所以个头不小。如果那个蛋白本身也很小的话，用超滤膜就
会出现不能把蛋白和detergent分开的现象。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 你说的“浓缩但不能用膜浓缩”指什么膜啊？
: 纯讨论
: 我也做结晶
: 不过是半路出家
: 所以很想知道不长晶体的时候除了蛋白本身以外是不是还有什么地方自己做的不对
: 我跟16楼shakuras一样
: 一直用的centricon和amicon
: 就是纯化完了以后透析，透析完了然后上centricon
: 溶液组分都是知道的
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l**********1
发帖数: 5204 | 26 sure
online PDF document:
HTTPS//extranet.fisher.co.uk/webfiles/uk/web-docs/UKLS_0691.PDF
055B
【在 k******0 的大作中提到】
: FDP-895-050L Spin column Vivapure Q mini M ion exchange FDP-895-055B
: Spin column Vivapure Q mini H ion exchange Vivascience
: 我喜欢用Q（阴离子）而不是S（阳离子），在生理pH大部分蛋白质都会结合。只有Q不
: 结合的蛋白使用S。
: 我用大柱，如果少量样品，用mini M的就行了。
: 其实有各种各样的柱子，如Ni，输水，亲和，各种色谱柱都有。根据需要挑选了。
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k******0
发帖数: 1073 | 27 detergent micelle挺大的，用30kDa MWCO都很难透析掉。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我猜他的意思是有些蛋白提纯的时候会有detergent 带进来，而detergent 本身
: 因为会形成那种小团状micelle（我为了写那个字都老羞成怒了，不小心就会
: 被改成michelle），所以个头不小。如果那个蛋白本身也很小的话，用超滤膜就
: 会出现不能把蛋白和detergent分开的现象。
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b******y
发帖数: 627 | 28 My guess is as following:
he/she is purifying membrane proteins (or protein complexes). Proper
interaction with detergent is required for its solubility and homogenous
behavior. Otherwise, it is death penalty for crystallization.
If using centricon or amicon, the protein sample will be overly concentrated
at the bottom of the tubes, so will be the detergent. In this case, it
might be over its critical concentration and therefore is likely to form
micelle (I don't have problem with michelle!). At least, the protein sample
becomes inhomogenous: some with more detergent and some with less. Most
likely, a substantial portion of protein will precipitate.
【在 s******y 的大作中提到】
: 我猜他的意思是有些蛋白提纯的时候会有detergent 带进来，而detergent 本身
: 因为会形成那种小团状micelle（我为了写那个字都老羞成怒了，不小心就会
: 被改成michelle），所以个头不小。如果那个蛋白本身也很小的话，用超滤膜就
: 会出现不能把蛋白和detergent分开的现象。
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k******0
发帖数: 1073 | 29 your guess is mostly right.
In my case, because detergent micelle (my detergent has a low CMC) cannot
pass through the concentration membrane and therefore will get concentrated
as well as the protein complex. Subunit interaction will get disrupted and
the protein complex will be broken apart by the high concentration of
detergent.
concentrated
sample
【在 b******y 的大作中提到】
: My guess is as following:
: he/she is purifying membrane proteins (or protein complexes). Proper
: interaction with detergent is required for its solubility and homogenous
: behavior. Otherwise, it is death penalty for crystallization.
: If using centricon or amicon, the protein sample will be overly concentrated
: at the bottom of the tubes, so will be the detergent. In this case, it
: might be over its critical concentration and therefore is likely to form
: micelle (I don't have problem with michelle!). At least, the protein sample
: becomes inhomogenous: some with more detergent and some with less. Most
: likely, a substantial portion of protein will precipitate.
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b******y
发帖数: 627 | 30 I see. make sense. thanks for sharing. |
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k******0
发帖数: 1073 | 31 如果没有detergent的话，用centricon浓缩，没有问题。
如果浓缩溶在detergent里的膜蛋白质，就不能用超滤膜浓缩，因为detergent 胶束也
会被浓缩。高浓度的detergent对蛋白质，特别是蛋白质复合体，有不利的影响。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 你说的“浓缩但不能用膜浓缩”指什么膜啊？
: 纯讨论
: 我也做结晶
: 不过是半路出家
: 所以很想知道不长晶体的时候除了蛋白本身以外是不是还有什么地方自己做的不对
: 我跟16楼shakuras一样
: 一直用的centricon和amicon
: 就是纯化完了以后透析，透析完了然后上centricon
: 溶液组分都是知道的
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k******0
发帖数: 1073 | 32 如果没有detergent的话，用centricon浓缩，没有问题。
如果浓缩溶在detergent里的膜蛋白质，就不能用超滤膜浓缩，因为detergent 胶束也
会被浓缩。高浓度的detergent对蛋白质，特别是蛋白质复合体，有不利的影响。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 你说的“浓缩但不能用膜浓缩”指什么膜啊？
: 纯讨论
: 我也做结晶
: 不过是半路出家
: 所以很想知道不长晶体的时候除了蛋白本身以外是不是还有什么地方自己做的不对
: 我跟16楼shakuras一样
: 一直用的centricon和amicon
: 就是纯化完了以后透析，透析完了然后上centricon
: 溶液组分都是知道的
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l**********1
发帖数: 5204 | 33 Sure
then LZ can try
Pierce Detergent Removal Spin Columns
manual PDF file:
//www.piercenet.com/instructions/2162164.pdf
or
//www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=25F159A5-5056-8A76-4E63-399F97138252
【在 k******0 的大作中提到】
: 如果没有detergent的话，用centricon浓缩，没有问题。
: 如果浓缩溶在detergent里的膜蛋白质，就不能用超滤膜浓缩，因为detergent 胶束也
: 会被浓缩。高浓度的detergent对蛋白质，特别是蛋白质复合体，有不利的影响。
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d***8
发帖数: 2039 | 34 放几个勤劳，会游泳的小蚂蚁进去。让他们把你的ATP都用掉。 |
C*******e
发帖数: 4348 | 35 非常感谢！
再请教一下为什么detergent是death penalty for crystallization？
另外包括甘油么？我听说为做结晶提蛋白的时候也不能用甘油
concentrated
sample
【在 b******y 的大作中提到】
: My guess is as following:
: he/she is purifying membrane proteins (or protein complexes). Proper
: interaction with detergent is required for its solubility and homogenous
: behavior. Otherwise, it is death penalty for crystallization.
: If using centricon or amicon, the protein sample will be overly concentrated
: at the bottom of the tubes, so will be the detergent. In this case, it
: might be over its critical concentration and therefore is likely to form
: micelle (I don't have problem with michelle!). At least, the protein sample
: becomes inhomogenous: some with more detergent and some with less. Most
: likely, a substantial portion of protein will precipitate.
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C*******e
发帖数: 4348 | 36 非常感谢！
【在 k******0 的大作中提到】
: 如果没有detergent的话，用centricon浓缩，没有问题。
: 如果浓缩溶在detergent里的膜蛋白质，就不能用超滤膜浓缩，因为detergent 胶束也
: 会被浓缩。高浓度的detergent对蛋白质，特别是蛋白质复合体，有不利的影响。
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k******0
发帖数: 1073 | 37 能不用就不用。甘油不是很纯的。
蛋白质溶液的原则是，只要蛋白质稳定可溶，溶液的成分越简单越好。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 非常感谢！
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i*****g
发帖数: 11893 | 38 楼主为什么要上HPLC？ facility people will not be happy about the P32.
G10, G25 may be a good choice to desalt the ATP, and it might lose some
proteins.
centricom or centricom-like spin column is suitable for >10ug protein. ug
amount of proteins from the phosphorylation assay could be lost after spin
column concentration. |
N2
发帖数: 81 | 39 一般的快速脱盐的柱子不能够达到你100%脱盐的要求.因为为保证回收录,洗的体积大,
总是有残留.
我们以前常用GE 的Disposable PD-10 Desalting Columns. 大约脱掉90%的样子.如果
这种柱子短,其实自己做一个长的就行了.重力洗脱就足够快了.
我建议楼主要有一个好的流程和组份的控制.
1)做一个预实验,如果有足够的样品.把洗脱液分成100-200ul收集. 然后做 Liquid
scintillation counting 32P,这样可知最大可收集的,没有32P的洗脱体积.
2)如果不希望太稀释样品,最前面的洗脱组分,用nanodrop测280nm吸收,没有多少蛋白的
,不要就好.
【在 e********r 的大作中提到】
: 最近用32P同位素标记的ATP做激酶活性，过程里需要将反应里的ATP完全除去，但保留
: 被磷酸化的蛋白。ATP需要除得非常干净，避免使后面加的蛋白磷酸化，同时又要除得
: 快，避免前面被磷酸化蛋白半衰期短。曾经试过用10K的超滤膜多换几次洗涤液，但做
: 下来要1个多小时，还是嫌时间太长。有熟悉的朋友请介绍介绍，谢谢！
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i*****g
发帖数: 11893 | 40 正好这几天干自己的事情，搜索 desalting的办法
看见了 pierce 有一堆产品
LZ可以串联两种方法，估计近乎100% desalting
http://www.thermo.com.cn/article.aspx?id=5157
Zeba desalting and sephadex，PAGE gel desalting
这些方法，无非两种，ion exchange, gel filtration，他们现成做好了产品可以用 |
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s********n
发帖数: 2939 | 41 离子交换是根据pI来的，pH>pI，anion exchange; pH
用size exclusion会比较方便 |
s********n
发帖数: 2939 | 42 离子交换是根据pI来的，pH>pI，anion exchange; pH
用size exclusion会比较方便 |
