z*******a
发帖数: 175 | 1 pictures from confocal microscopy on a small sized tissue
have to do quantification using imageJ
got ~2 fold difference between 2 groups
questions:
are intensities of immunostaining are stoichiometric?
variation is so big; seems not believable and not reproducible even by
myself; so is the quantification of immunofluorescence
meaningful at all? especially in tissue instead of cultured cells |
n***w
发帖数: 2405 | 2 IF you are just quantifying using the stacked images, I don't think it is
stoichiometric.
I found a difference in my images and I am trying to use Western blot to see
if I can see a similar difference. |
b******s
发帖数: 1089 | 3 我觉得你这个还是换个方法吧。
免疫荧光一抗二抗结合效率在不同sample，不同处理都变化很大。甚至跟你incubation
的温度和时间都有关系。即便是完全一样的几组sample同样的处理，quantification都
是非常不准确的。
采用这样的方法意义不大，如果是指导下面的实验，你敢相信结果吗？
如果是要发表的数据，一定会被reviewers搞的很惨的。结果都是白花了力气。
【在 z*******a 的大作中提到】
: pictures from confocal microscopy on a small sized tissue
: have to do quantification using imageJ
: got ~2 fold difference between 2 groups
: questions:
: are intensities of immunostaining are stoichiometric?
: variation is so big; seems not believable and not reproducible even by
: myself; so is the quantification of immunofluorescence
: meaningful at all? especially in tissue instead of cultured cells
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z*******a
发帖数: 175 | 4 多谢多谢
我是坚决不信immunofluorescence定量，尤其差别不是特别大。被逼的，没法呀。
你说“一定会被reviewers搞的很惨的”，会被咋搞？
incubation
【在 b******s 的大作中提到】
: 我觉得你这个还是换个方法吧。
: 免疫荧光一抗二抗结合效率在不同sample，不同处理都变化很大。甚至跟你incubation
: 的温度和时间都有关系。即便是完全一样的几组sample同样的处理，quantification都
: 是非常不准确的。
: 采用这样的方法意义不大，如果是指导下面的实验，你敢相信结果吗？
: 如果是要发表的数据，一定会被reviewers搞的很惨的。结果都是白花了力气。
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b******s
发帖数: 1089 | 5 如果你依据不可靠的方法得出结论，即便是文章里可有可无的小结论，reviewers都会
对你的可靠性产生怀疑。你可能需要做更多艰难的实验去证明这个小结论，甚至连带你
文章里的其他结论。
【在 z*******a 的大作中提到】
: 多谢多谢
: 我是坚决不信immunofluorescence定量，尤其差别不是特别大。被逼的，没法呀。
: 你说“一定会被reviewers搞的很惨的”，会被咋搞？
:
: incubation
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z*******a
发帖数: 175 | 6 thanks a lot
very small sized tissue, and only 5 positive cells. western is mission
impossible 哈
see
【在 n***w 的大作中提到】
: IF you are just quantifying using the stacked images, I don't think it is
: stoichiometric.
: I found a difference in my images and I am trying to use Western blot to see
: if I can see a similar difference.
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z*******a
发帖数: 175 | 7 有道理。谢了
【在 b******s 的大作中提到】
: 如果你依据不可靠的方法得出结论，即便是文章里可有可无的小结论，reviewers都会
: 对你的可靠性产生怀疑。你可能需要做更多艰难的实验去证明这个小结论，甚至连带你
: 文章里的其他结论。
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z*******a
发帖数: 175 | 8 再说， 确有很多很多paper show 1.5 fold difference. 还带星号，有统计意义。
我若搞不定，岂非被认为无能？
【在 b******s 的大作中提到】
: 如果你依据不可靠的方法得出结论，即便是文章里可有可无的小结论，reviewers都会
: 对你的可靠性产生怀疑。你可能需要做更多艰难的实验去证明这个小结论，甚至连带你
: 文章里的其他结论。
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l***y
发帖数: 4671 | 9 要定性需要 positive/negative controls and p-values. 要定量需要工作曲线，线性
段，quality controls。
萤光当然可以半定量，但工作量很大，很不reliable。比别的方法要难。而且哪怕你做
得很让人信服，按惯例还是要用另一种独立方法来验证。
【在 z*******a 的大作中提到】
: pictures from confocal microscopy on a small sized tissue
: have to do quantification using imageJ
: got ~2 fold difference between 2 groups
: questions:
: are intensities of immunostaining are stoichiometric?
: variation is so big; seems not believable and not reproducible even by
: myself; so is the quantification of immunofluorescence
: meaningful at all? especially in tissue instead of cultured cells
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D*a
发帖数: 6830 | 10 免疫荧光半定量还是可以的吧，只要严格处理样品也是不可以的，很多这类的数据都发
表了啊。比如你sample处理要很一致，比如所有的切片同一天染色等等等等，然后拍照
片的时候必须都用同样参数，不能饱和，等等等等。。。然后拍照片的区域要大家都差
不多，等等等等。
有的时候很难用其他办法吧？比如我A蛋白cell specific KO了是否引起B蛋白上调，但
是我的组织里面有n种细胞，很可能有相邻细胞影响，我用WB或者mRNA分不出来到底是
谁啊，用流式分细胞是不是处理过程中会改变啊，。。。 |
s*****j
发帖数: 6435 | 11 我怎么觉得很多时候是reviewer非要你定量地给个数字出来.
incubation
【在 b******s 的大作中提到】
: 我觉得你这个还是换个方法吧。
: 免疫荧光一抗二抗结合效率在不同sample，不同处理都变化很大。甚至跟你incubation
: 的温度和时间都有关系。即便是完全一样的几组sample同样的处理，quantification都
: 是非常不准确的。
: 采用这样的方法意义不大，如果是指导下面的实验，你敢相信结果吗？
: 如果是要发表的数据，一定会被reviewers搞的很惨的。结果都是白花了力气。
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