b**********8
发帖数: 349 | 1 要变两个base，CT to AA,用的stratagene的试剂盒，做了两次，每次挑5个克隆测序分
析，突变成功，但是每个克隆在突变位点之后大约20bp开始出现大片段的mismatch，测
序峰形都很好，到底是个什么情况？除了重新设计引物还有别的办法吗？ |
a******8
发帖数: 56 | 2 try changing your PCR condition. |
r****r
发帖数: 36 | 3 why not try overlapping PCR? |
b**********8
发帖数: 349 | 4 目前用的是这个条件，
Pfu PCR reaction (1 reaction):
Forward Primer (10 μM) 0.5 μl
Reverse Primer (10 μM) 0.5 μl
Template (50ng) 1.0 μl
Pfu Ultra 0.5 μl
dNTP (25 mM) 0.5 μl
Buffer 2.5 μl
MilliQ 19.5 μl
25.0 μl
Thermal cycling condition:
95ºC 2 min
95ºC 30 sec
55ºC 30 sec
72ºC 4 min
25 cycles
72ºC 7 min
4ºC ∞
请问可以如何改进？
多谢关注和回复 |
b**********8
发帖数: 349 | 5 Good idea。
Thanks
【在 r****r 的大作中提到】
: why not try overlapping PCR?
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s********n
发帖数: 2939 | 6 你确定这些条件是manual里建议的吗？
【在 b**********8 的大作中提到】
: 目前用的是这个条件，
: Pfu PCR reaction (1 reaction):
: Forward Primer (10 μM) 0.5 μl
: Reverse Primer (10 μM) 0.5 μl
: Template (50ng) 1.0 μl
: Pfu Ultra 0.5 μl
: dNTP (25 mM) 0.5 μl
: Buffer 2.5 μl
: MilliQ 19.5 μl
: 25.0 μl
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b**********8
发帖数: 349 | 7 可能有少少改动，但是我们组用这个条件已经很多年了，都挺顺利的，我之前也用过这
个方案做一个突变，效果挺好。这次同时做了4个位点的突变，3个都很顺利，唯独这一
个比较麻烦，重复过两次，唯一的改动是退火温度由53度升到55度，测序结果都发现虽
然突变成功，但是突变位点之后20bp开始出现大片段的mismatch |
r****r
发帖数: 36 | 8 could you send the mismatch sequence to BLAST and see what it really is?
sounds like a very interesting and robust recombination between DNA strands. |
L*****t
发帖数: 56 | 9 Extension太长了，减一半。Final Extension不要做 |
i***l
发帖数: 1656 | 10 gc% of your template?
seems it is from the features of your template, not the kit
try old school methods like 2 piece pcr........
【在 b**********8 的大作中提到】
: 要变两个base，CT to AA,用的stratagene的试剂盒，做了两次，每次挑5个克隆测序分
: 析，突变成功，但是每个克隆在突变位点之后大约20bp开始出现大片段的mismatch，测
: 序峰形都很好，到底是个什么情况？除了重新设计引物还有别的办法吗？
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b**********8
发帖数: 349 | 11 谢谢楼上各位回复。
回rosner ：突变后的序列基本上还是原来目的基因的序列，只不过突然出现了频繁的
mismatch
回Laforet：extension会影响结果吗？
回icool：质粒是一个基因的核心启动子序列连到PGL3-basic 上来的，GC含量确实很高
，70%以上。2 piece PCR 是否就是overlapping PCR？
再次感谢各位。 |
l**********1
发帖数: 5204 | |
