m******5
发帖数: 1383 | 1 在排除样品质量的情况下
用RNA ligase mediated 5'RACE得到的transcription starting site和最早报道的用
cDNA library测序得到的starting site很不一样 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 两者都有出错的可能，两者都可能是对的（RNA起始位点是可以变的）。
一般而言，在换条件多次重复的情况下，RACE的结果比较可信
【在 m******5 的大作中提到】
: 在排除样品质量的情况下
: 用RNA ligase mediated 5'RACE得到的transcription starting site和最早报道的用
: cDNA library测序得到的starting site很不一样
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m******5
发帖数: 1383 | 3 重复了很多次，也用commercial available的RNA重复过了
我用的RACE得到的TSS更靠3‘端，另外，我用的RACE是5'cap dependent的，所以原理
上更可能直接和translation product有关
我比较想知道cDNA library那个特别长的RNA isoform是哪来的，后来再也没人重复过
，junk product?
【在 s******y 的大作中提到】
: 两者都有出错的可能，两者都可能是对的（RNA起始位点是可以变的）。
: 一般而言，在换条件多次重复的情况下，RACE的结果比较可信
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s******y
发帖数: 28562 | 4 有可能就是他们做库的时候拼错了序列。或者库样品的细胞来源和你们做的不一样
（这个有可能有组织差异的）
【在 m******5 的大作中提到】
: 重复了很多次，也用commercial available的RNA重复过了
: 我用的RACE得到的TSS更靠3‘端，另外，我用的RACE是5'cap dependent的，所以原理
: 上更可能直接和translation product有关
: 我比较想知道cDNA library那个特别长的RNA isoform是哪来的，后来再也没人重复过
: ，junk product?
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m******5
发帖数: 1383 | 5 借这个帖子再请教您一个问题
在stable transfection linealize的plasmid的时候，您个人认为有必要PCR amplify
full length integrated plasmid么？还是挑特征序列amplify一下一般就足够了？
【在 s******y 的大作中提到】
: 有可能就是他们做库的时候拼错了序列。或者库样品的细胞来源和你们做的不一样
: （这个有可能有组织差异的）
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s******y
发帖数: 28562 | 6 既然你的plasmid 都整合进去了，一般就是直接用WB 来确认整进去的蛋白是否表达更
直接，
然后同时挑个特征序列做个genotype就好了。
chromotin DNA 测序很麻烦的，一般不到万不得已不会做。（比方说出了很奇怪的表状）
amplify
【在 m******5 的大作中提到】
: 借这个帖子再请教您一个问题
: 在stable transfection linealize的plasmid的时候，您个人认为有必要PCR amplify
: full length integrated plasmid么？还是挑特征序列amplify一下一般就足够了？
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m******5
发帖数: 1383 | 7 我那个要到干细胞分化的特定天数才表达，而且很多条件要掌握好。
不过似乎一般认为linealize的plasmid 整合后就是整段整合了，我似乎只需要挑三个
克隆来排除positional effect就行了
状）
【在 s******y 的大作中提到】
: 既然你的plasmid 都整合进去了，一般就是直接用WB 来确认整进去的蛋白是否表达更
: 直接，
: 然后同时挑个特征序列做个genotype就好了。
: chromotin DNA 测序很麻烦的，一般不到万不得已不会做。（比方说出了很奇怪的表状）
:
: amplify
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s******y
发帖数: 28562 | 8 这个我可就不敢打包票了。但是常规方法里的确是用genotype 确定就行了，然后等
要表达的时候能测到带应该就没有问题了。
【在 m******5 的大作中提到】
: 我那个要到干细胞分化的特定天数才表达，而且很多条件要掌握好。
: 不过似乎一般认为linealize的plasmid 整合后就是整段整合了，我似乎只需要挑三个
: 克隆来排除positional effect就行了
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: 状）
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m******5
发帖数: 1383 | 9 是不能打保票啊……不过就是有点神经兮兮的，另外plasmid全长太triky了不好做
现在手头就只有特征序列PCR genotyping结果
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个我可就不敢打包票了。但是常规方法里的确是用genotype 确定就行了，然后等
: 要表达的时候能测到带应该就没有问题了。
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