s***i
发帖数: 160 | 1 周一到今天连续每天跑两个胶
结果每个都有问题
取成年小黑鼠样本
测PDK1，P-PDK1 还有其他protein
第一次的样本是上星期做的，结果pdk1 和P—pdk1 各出来bands，PDK比 P-PDK弱，第
一个不解
怀疑操作有问题，另取样本重新制作，第二次PDK没显示出来，P-PDK却一直存在，只不
过对比第一次稍弱
因为只load10ug跑胶，怀疑太少重复第三次，20ug，其他条件和第一次一样
结果PDK1还是没有显示 P—PDK1有显示
怀疑抗体浓度不够，今天使用一抗和二抗都用1：500，之前一直用1：1000
换用TPS—T 冲洗，之前都用PBS—T
另外操作过程反复检查过，把蛋白转到膜后ponceau检查没有问题，5%nonfat milk
incubate 1.30小时，冲洗都足15min，一抗体4度冰箱过夜，冲洗三次后二抗两小时，
再冲洗三次。抗体用的是cell signaling technology的。
百思不得其解，为啥第一次显示得出来~
另外同在一个胶跑的还有AKT和P-AKT，AKT显示正常，就是P-AKT有超多nonspecific
bands，有什么办法可以改进吗？ | s***i
发帖数: 160 | 2 今天停止实验，彻查问题
有大牛可以帮忙给些建议吗？ | g********0
发帖数: 6201 | 3 １。并不是你说每步操作（特别是转膜）没问题就没问题的，找个老手帮你看看。
２。不同组织目标蛋白含量不一样，对抗体的反应也不一样，对同样抗体，有些组织带
就很干净，有些就出杂band。
３。cell signaling似乎鼠源抗体效果强于兔源抗体。
４。在效果不好的情况下，就不要再用最便宜的那种２５０ml一大瓶的普通ECL发光液
了。卖贵一点的 ECL plus或ECL extra之类的增强液。 | h*******o
发帖数: 4884 | 4 p-PDK和PDK用得不是同一个抗体,不同抗体质量差距太大了, 强弱不能简单的比较
一般做pProtein/Protein都是先p在strip做总的,像你这种情况的话,我的建议是
parallel 跑两块一样的胶,一块做pPDK一块用个强一点的Femto显影做PDK就行了
至于AKT和P-AKT,我用过cell signaling 的p-AKT具体哪一个忘记了,band非常specific
.
另外二抗用的太高浓度了, 一般条带出不来,提高二抗是没有用的,反而会增加背景或者非特异性的条带
普通ECL的话,二抗我都是1:10000-20000 | s***i
发帖数: 160 | 5 多谢两位的指教
下周根据意见改进
我通常是用普通ECL显示 然后再把半个小时还没有显示的膜再用supersignal显示一遍
不过通常普通ECL显示不出来 super也没辙
上面的PDK就是这样的例子 | s***i
发帖数: 160 | 6 请问Hellozero
我做这个实验就是要看PDK和P-PDK在同一个组织中显示出来量的不同
和对比不同组织的情况
你说不同抗体不能对比的话 那应该在怎么样对比两个的量呢？
今天再看发现AKT/P-AKT用的不是cell signaling的，是santa cruz的。这是唯一一个
不是cell那个公司的抗体
我实验室一哥们一直在用，不过他只取特定size的band 所以有nonspecific band他也
不知道
我在想是不是抗体的问题
我刚进实验室 有很多东西其实都不懂，真正菜鸟一只
specific
者非特异性的条带
【在 h*******o 的大作中提到】
: p-PDK和PDK用得不是同一个抗体,不同抗体质量差距太大了, 强弱不能简单的比较
: 一般做pProtein/Protein都是先p在strip做总的,像你这种情况的话,我的建议是
: parallel 跑两块一样的胶,一块做pPDK一块用个强一点的Femto显影做PDK就行了
: 至于AKT和P-AKT,我用过cell signaling 的p-AKT具体哪一个忘记了,band非常specific
: .
: 另外二抗用的太高浓度了, 一般条带出不来,提高二抗是没有用的,反而会增加背景或者非特异性的条带
: 普通ECL的话,二抗我都是1:10000-20000
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