a*****h
发帖数: 67 | 1 最近在做一个有2个Trp 残基蛋白的Fluo spectrum（290nm激发，300-400nm的波普. 本
来想把两个Trp都给敲掉后做负对照用的，可是突变的蛋白纯化出来后发现还是有很高
的荧光信号(接近WT的水平，稍低），不知道这个正常么？从哪里可以找到Trp/蛋白的
intrinsic fluo的信息啊？先谢过了！ |
e****s
发帖数: 1125 | 2 你怎么测蛋白浓度的？
【在 a*****h 的大作中提到】
: 最近在做一个有2个Trp 残基蛋白的Fluo spectrum（290nm激发，300-400nm的波普. 本
: 来想把两个Trp都给敲掉后做负对照用的，可是突变的蛋白纯化出来后发现还是有很高
: 的荧光信号(接近WT的水平，稍低），不知道这个正常么？从哪里可以找到Trp/蛋白的
: intrinsic fluo的信息啊？先谢过了！
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y****p
发帖数: 5 | 3 是在变性条件下比较的吗？ Trp fluo和周围环境有关系的，这种情况是有可能的，特
别是tyr的背景高的话。
【在 a*****h 的大作中提到】
: 最近在做一个有2个Trp 残基蛋白的Fluo spectrum（290nm激发，300-400nm的波普. 本
: 来想把两个Trp都给敲掉后做负对照用的，可是突变的蛋白纯化出来后发现还是有很高
: 的荧光信号(接近WT的水平，稍低），不知道这个正常么？从哪里可以找到Trp/蛋白的
: intrinsic fluo的信息啊？先谢过了！
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a*****h
发帖数: 67 | 4 谢谢了~
我根据A280 和 Theoretical Molar Extinction Coefficient 算的浓度，这个误差很
多么？ 不过我算浓度的时候没把那个差的分子量（Trp到Phe的分子量差）和
Theoretical Molar Extinction Coefficient算进去,我重新定量下再测下看吧：）
【在 e****s 的大作中提到】
: 你怎么测蛋白浓度的？
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a*****h
发帖数: 67 | 5 先谢谢您的回复~
不是变性条件测的，是refold之后的条件下测的，蛋白里面除了2个Trp外（我给突变成
Phe了）还有4个Tyr残基，Tyr对290激发的Fluo光谱背景影响很大么？请问您知道从哪
里能找到关于这些氨基酸intrinsic fluo的信息啊，谢谢啦！
【在 y****p 的大作中提到】
: 是在变性条件下比较的吗？ Trp fluo和周围环境有关系的，这种情况是有可能的，特
: 别是tyr的背景高的话。
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e****s
发帖数: 1125 | 6 你基本已经回答你自己的问题了。
A280同Trp荧光一样主要贡献来自Trp,你mutants里不含有Trp，自然摩尔吸光系数也极
大的下降了，而且这个下降和荧光下降是一致的。
所以你观察到的的突变荧光之所以高是由于实际蛋白浓度高了很多。我推测你突变荧光
图谱的Base line会比WT高很多。
用Bradford assay或者是去Protein claculator算下突变的摩尔吸光系数。建议
Bradford。
Good luck!
【在 a*****h 的大作中提到】
: 谢谢了~
: 我根据A280 和 Theoretical Molar Extinction Coefficient 算的浓度，这个误差很
: 多么？ 不过我算浓度的时候没把那个差的分子量（Trp到Phe的分子量差）和
: Theoretical Molar Extinction Coefficient算进去,我重新定量下再测下看吧：）
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a*****h
发帖数: 67 | 7 谢谢了，今天正在测，等会儿看看结果再说:)
【在 e****s 的大作中提到】
: 你基本已经回答你自己的问题了。
: A280同Trp荧光一样主要贡献来自Trp,你mutants里不含有Trp，自然摩尔吸光系数也极
: 大的下降了，而且这个下降和荧光下降是一致的。
: 所以你观察到的的突变荧光之所以高是由于实际蛋白浓度高了很多。我推测你突变荧光
: 图谱的Base line会比WT高很多。
: 用Bradford assay或者是去Protein claculator算下突变的摩尔吸光系数。建议
: Bradford。
: Good luck!
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