c********r
发帖数: 189 | 1 打算做一个transcription factor的 co-IP，这个蛋白主要在核内表达，表达量不高，
RIPA buffer提的话，这个蛋白不溶解，还在pellet内。可以用高盐和denature来提，
但是就影响protein interaction了。
问问大伙，用什么方法裂解细胞或细胞核比较好？
很多paper中看到，cryolysis的方法比较好，但是实验室没有相关的设备。 | L*******e
发帖数: 2153 | 2 sonication first then +/- Benzonase to get rid of non-specific binding
caused by RNA/DNA dependent interaction?
【在 c********r 的大作中提到】
: 打算做一个transcription factor的 co-IP，这个蛋白主要在核内表达，表达量不高，
: RIPA buffer提的话，这个蛋白不溶解，还在pellet内。可以用高盐和denature来提，
: 但是就影响protein interaction了。
: 问问大伙，用什么方法裂解细胞或细胞核比较好？
: 很多paper中看到，cryolysis的方法比较好，但是实验室没有相关的设备。
| c********b
发帖数: 363 | 3 楼上的思路不错。
其实方法很多，但是比较简单的还是先crosslink，然后再用 harsh buffer把核裂开，
然后复性，最后该干嘛干嘛。
这里有一篇你可以参考：Rapid and phosphoinositol-dependent binding of the SWI
/SNF-like BAF complex to chromatin after T lymphocyte receptor signaling
我自己用的protocol是这样的：
如果只是检测蛋白表达:
用High SDS buffer:
15 mM Tris pH 8.8, 5% SDS
0.3 M DTT, 15% Glycerol
我的是植物细胞,一般是liquid nitrogen grind之后加buffer,boil.如果是cell line,
collect细胞之后加上buffer 然后直接煮.除非是非常不稳定的蛋白,不然连protease
inhibitor都可以不加.
看到蛋白之后如果是做IP:
先crosslonk(用什么chemical得自己琢磨),然后把ripa的SDS含量加到1% ,sonicate,
centrifuge,得到supernant之后可以直接用10倍体积的稀释buffer做IP(稀释buffer:
ph7, 150-300 mM的NaCl, 0.5-1% Triton X-100).
good luck
【在 c********r 的大作中提到】
: 打算做一个transcription factor的 co-IP，这个蛋白主要在核内表达，表达量不高，
: RIPA buffer提的话，这个蛋白不溶解，还在pellet内。可以用高盐和denature来提，
: 但是就影响protein interaction了。
: 问问大伙，用什么方法裂解细胞或细胞核比较好？
: 很多paper中看到，cryolysis的方法比较好，但是实验室没有相关的设备。
| c********r
发帖数: 189 | 4
刚cruise回来，你的方法不错，可以试试，这个蛋白不是很稳定，可能先crosslink下
比较好？
【在 L*******e 的大作中提到】
: sonication first then +/- Benzonase to get rid of non-specific binding
: caused by RNA/DNA dependent interaction?
| c********r
发帖数: 189 | 5
SWI
谢谢了
【在 c********b 的大作中提到】
: 楼上的思路不错。
: 其实方法很多，但是比较简单的还是先crosslink，然后再用 harsh buffer把核裂开，
: 然后复性，最后该干嘛干嘛。
: 这里有一篇你可以参考：Rapid and phosphoinositol-dependent binding of the SWI
: /SNF-like BAF complex to chromatin after T lymphocyte receptor signaling
: 我自己用的protocol是这样的：
: 如果只是检测蛋白表达:
: 用High SDS buffer:
: 15 mM Tris pH 8.8, 5% SDS
: 0.3 M DTT, 15% Glycerol
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