s******y
发帖数: 28562 | 1 我们有一个蛋白，没有连GFP的时候很容易被一个抗体识别（肯定是特异信号，
因为有纯化蛋白，WT and KO control有非常好的识别），但是连上GFP之后就
没有识别了！换了另外一个抗体，也是一样结果！
大家遇到过这种情况么？我们的初步判断是这个GFP 因为有内部共价键，
所以不能被SDS完全变性，所以可能一大团东西摆在那里挡住了抗原位置。
这个该怎么处理？如果要做antigen retrieval怎么搞？ |
c**n
发帖数: 73 | 2 boiling in the microwave
见过有人用这个使一个WB work了
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们有一个蛋白，没有连GFP的时候很容易被一个抗体识别（肯定是特异信号，
: 因为有纯化蛋白，WT and KO control有非常好的识别），但是连上GFP之后就
: 没有识别了！换了另外一个抗体，也是一样结果！
: 大家遇到过这种情况么？我们的初步判断是这个GFP 因为有内部共价键，
: 所以不能被SDS完全变性，所以可能一大团东西摆在那里挡住了抗原位置。
: 这个该怎么处理？如果要做antigen retrieval怎么搞？
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y******8
发帖数: 1764 | 3 Could you detect GFP fluorescence in SDS-PAGE Gel? Did this fluorescence
appear at the expected molecular weight? |
s******y
发帖数: 28562 | 4 我们有anti-GFP抗体，的确在预测的位置上。但是我们想用这个做某些其它事情，
所以必须用原来的抗体来检测。单用GFP 的话reviewer 不会放过我们的。
【在 y******8 的大作中提到】
: Could you detect GFP fluorescence in SDS-PAGE Gel? Did this fluorescence
: appear at the expected molecular weight?
|
s******y
发帖数: 28562 | 5 有没有参考文献啊. 谢谢了!
【在 c**n 的大作中提到】
: boiling in the microwave
: 见过有人用这个使一个WB work了
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y******8
发帖数: 1764 | 6 I missed your point.
Did WB after GFP IP work?
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们有anti-GFP抗体，的确在预测的位置上。但是我们想用这个做某些其它事情，
: 所以必须用原来的抗体来检测。单用GFP 的话reviewer 不会放过我们的。
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c**n
发帖数: 73 | 7 Detection of APP Intracellular Domain in Brain Tissue
Sanjay W. Pimplikar and Anupama Suryanarayana
我弄错了一个细节,他们直接把膜放在沸水里面,而不是微波炉.
【在 s******y 的大作中提到】
: 有没有参考文献啊. 谢谢了!
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f********n
发帖数: 6465 | 8 我研究室就是在连上一个TAG后，WESTERBLOT就做不出来了。原因一直都不知道。 |
s******y
发帖数: 28562 | 9 不work.
即使是纯化出来的fusion protein，只要有那个GFP在, 针对原来的靶蛋白的抗体
就不work.但是又不能把GFP 切了，因为设计的时候没有考虑到这个因素，所以没有放
可以切的tag（教训啊！）
这个肯定是受到fusion GFP 的影响，因为我们有很多证据。
而且我们有特殊原因，还非得用原来设计的抗体不可，所以不能省了这一步。
除非我们一咬牙把辛苦设计好的蛋白以及前面几年做的工作全部扔了从头再设计，但是
这个是last resort, 所以千万不要劝我们想别的方法。呵呵。
【在 y******8 的大作中提到】
: I missed your point.
: Did WB after GFP IP work?
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i*****g
发帖数: 11893 | 10 用DTT还原
SDS浓度提高些，外加什么 胆固醇类变性剂
变性后再blot transfer
就这些招数了 |
|
|
s******y
发帖数: 28562 | 11 胆固醇类变性剂 都包括什么？我中文不好。。。呵呵，其实是中文学术名词不好。。。
【在 i*****g 的大作中提到】
: 用DTT还原
: SDS浓度提高些，外加什么 胆固醇类变性剂
: 变性后再blot transfer
: 就这些招数了
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s******y
发帖数: 28562 | 12 Thanks! I will give it a try
【在 c**n 的大作中提到】
: Detection of APP Intracellular Domain in Brain Tissue
: Sanjay W. Pimplikar and Anupama Suryanarayana
: 我弄错了一个细节,他们直接把膜放在沸水里面,而不是微波炉.
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i*****g
发帖数: 11893 | 13 option1: SDS-PAGE gel running buffer +20% ethanol=WB transfer buffer
hopefully protein would not renature after blot transfer
option2: new samp prep buffer with guanidine-HCL, sodium dexochlate
http://en.wikipedia.org/wiki/Deoxycholic_acid
option3: reducing alkylation kit for proteomics(it could be expensive as it
handle tiny amount of proteins for mass spec)
alkylating agent, iodoacetamide.
option4: in gel protein fragmentation via chemical cleavage before blot
transfer
option1-----4 easiness of handling experiments decreased |
i***l
发帖数: 1656 | 14 蛋白胶Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ，
上 ５Ｍ Ｕｒｅａ ＋５％ＳＤＳ ＋０．５％ Ｂ－巯基乙醇， 煮沸？
膜蛋白不要煮沸，反而～４０度左右更好。
。。
【在 s******y 的大作中提到】
: 胆固醇类变性剂 都包括什么？我中文不好。。。呵呵，其实是中文学术名词不好。。。
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s******y
发帖数: 28562 | 15 guanidine-HCL 浓度高的时候好像会严重影响跑胶的样子呢，我以前用6M
guanidine 做出的样品跑起来严重拖带，这个问题怎么解决？
it
【在 i*****g 的大作中提到】
: option1: SDS-PAGE gel running buffer +20% ethanol=WB transfer buffer
: hopefully protein would not renature after blot transfer
: option2: new samp prep buffer with guanidine-HCL, sodium dexochlate
: http://en.wikipedia.org/wiki/Deoxycholic_acid
: option3: reducing alkylation kit for proteomics(it could be expensive as it
: handle tiny amount of proteins for mass spec)
: alkylating agent, iodoacetamide.
: option4: in gel protein fragmentation via chemical cleavage before blot
: transfer
: option1-----4 easiness of handling experiments decreased
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s******y
发帖数: 28562 | 16 让我试试看。。。
【在 i***l 的大作中提到】
: 蛋白胶Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ，
: 上 ５Ｍ Ｕｒｅａ ＋５％ＳＤＳ ＋０．５％ Ｂ－巯基乙醇， 煮沸？
: 膜蛋白不要煮沸，反而～４０度左右更好。
:
: 。。
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i*****g
发帖数: 11893 | 17 i know, the lane swells. no solution.
【在 s******y 的大作中提到】
: guanidine-HCL 浓度高的时候好像会严重影响跑胶的样子呢，我以前用6M
: guanidine 做出的样品跑起来严重拖带，这个问题怎么解决？
:
: it
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y******8
发帖数: 1764 | 18 second this, Urea + high b-ME should work.
【在 s******y 的大作中提到】
: 让我试试看。。。
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s******y
发帖数: 28562 | 19 谢谢！等试出结果来了一定来告诉大家：）
【在 y******8 的大作中提到】
: second this, Urea + high b-ME should work.
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s******y
发帖数: 28562 | 20 我们有一个蛋白，没有连GFP的时候很容易被一个抗体识别（肯定是特异信号，
因为有纯化蛋白，WT and KO control有非常好的识别），但是连上GFP之后就
没有识别了！换了另外一个抗体，也是一样结果！
大家遇到过这种情况么？我们的初步判断是这个GFP 因为有内部共价键，
所以不能被SDS完全变性，所以可能一大团东西摆在那里挡住了抗原位置。
这个该怎么处理？如果要做antigen retrieval怎么搞？ |
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c**n
发帖数: 73 | 21 boiling in the microwave
见过有人用这个使一个WB work了
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们有一个蛋白，没有连GFP的时候很容易被一个抗体识别（肯定是特异信号，
: 因为有纯化蛋白，WT and KO control有非常好的识别），但是连上GFP之后就
: 没有识别了！换了另外一个抗体，也是一样结果！
: 大家遇到过这种情况么？我们的初步判断是这个GFP 因为有内部共价键，
: 所以不能被SDS完全变性，所以可能一大团东西摆在那里挡住了抗原位置。
: 这个该怎么处理？如果要做antigen retrieval怎么搞？
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y******8
发帖数: 1764 | 22 Could you detect GFP fluorescence in SDS-PAGE Gel? Did this fluorescence
appear at the expected molecular weight? |
s******y
发帖数: 28562 | 23 我们有anti-GFP抗体，的确在预测的位置上。但是我们想用这个做某些其它事情，
所以必须用原来的抗体来检测。单用GFP 的话reviewer 不会放过我们的。
【在 y******8 的大作中提到】
: Could you detect GFP fluorescence in SDS-PAGE Gel? Did this fluorescence
: appear at the expected molecular weight?
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s******y
发帖数: 28562 | 24 有没有参考文献啊. 谢谢了!
【在 c**n 的大作中提到】
: boiling in the microwave
: 见过有人用这个使一个WB work了
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y******8
发帖数: 1764 | 25 I missed your point.
Did WB after GFP IP work?
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们有anti-GFP抗体，的确在预测的位置上。但是我们想用这个做某些其它事情，
: 所以必须用原来的抗体来检测。单用GFP 的话reviewer 不会放过我们的。
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c**n
发帖数: 73 | 26 Detection of APP Intracellular Domain in Brain Tissue
Sanjay W. Pimplikar and Anupama Suryanarayana
我弄错了一个细节,他们直接把膜放在沸水里面,而不是微波炉.
【在 s******y 的大作中提到】
: 有没有参考文献啊. 谢谢了!
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f********n
发帖数: 6465 | 27 我研究室就是在连上一个TAG后，WESTERBLOT就做不出来了。原因一直都不知道。 |
s******y
发帖数: 28562 | 28 不work.
即使是纯化出来的fusion protein，只要有那个GFP在, 针对原来的靶蛋白的抗体
就不work.但是又不能把GFP 切了，因为设计的时候没有考虑到这个因素，所以没有放
可以切的tag（教训啊！）
这个肯定是受到fusion GFP 的影响，因为我们有很多证据。
而且我们有特殊原因，还非得用原来设计的抗体不可，所以不能省了这一步。
除非我们一咬牙把辛苦设计好的蛋白以及前面几年做的工作全部扔了从头再设计，但是
这个是last resort, 所以千万不要劝我们想别的方法。呵呵。
【在 y******8 的大作中提到】
: I missed your point.
: Did WB after GFP IP work?
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i*****g
发帖数: 11893 | 29 用DTT还原
SDS浓度提高些，外加什么 胆固醇类变性剂
变性后再blot transfer
就这些招数了 |
s******y
发帖数: 28562 | 30 胆固醇类变性剂 都包括什么？我中文不好。。。呵呵，其实是中文学术名词不好。。。
【在 i*****g 的大作中提到】
: 用DTT还原
: SDS浓度提高些，外加什么 胆固醇类变性剂
: 变性后再blot transfer
: 就这些招数了
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s******y
发帖数: 28562 | 31 Thanks! I will give it a try
【在 c**n 的大作中提到】
: Detection of APP Intracellular Domain in Brain Tissue
: Sanjay W. Pimplikar and Anupama Suryanarayana
: 我弄错了一个细节,他们直接把膜放在沸水里面,而不是微波炉.
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i*****g
发帖数: 11893 | 32 option1: SDS-PAGE gel running buffer +20% ethanol=WB transfer buffer
hopefully protein would not renature after blot transfer
option2: new samp prep buffer with guanidine-HCL, sodium dexochlate
http://en.wikipedia.org/wiki/Deoxycholic_acid
option3: reducing alkylation kit for proteomics(it could be expensive as it
handle tiny amount of proteins for mass spec)
alkylating agent, iodoacetamide.
option4: in gel protein fragmentation via chemical cleavage before blot
transfer
option1-----4 easiness of handling experiments decreased |
i***l
发帖数: 1656 | 33 蛋白胶Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ，
上 ５Ｍ Ｕｒｅａ ＋５％ＳＤＳ ＋０．５％ Ｂ－巯基乙醇， 煮沸？
膜蛋白不要煮沸，反而～４０度左右更好。
。。
【在 s******y 的大作中提到】
: 胆固醇类变性剂 都包括什么？我中文不好。。。呵呵，其实是中文学术名词不好。。。
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s******y
发帖数: 28562 | 34 guanidine-HCL 浓度高的时候好像会严重影响跑胶的样子呢，我以前用6M
guanidine 做出的样品跑起来严重拖带，这个问题怎么解决？
it
【在 i*****g 的大作中提到】
: option1: SDS-PAGE gel running buffer +20% ethanol=WB transfer buffer
: hopefully protein would not renature after blot transfer
: option2: new samp prep buffer with guanidine-HCL, sodium dexochlate
: http://en.wikipedia.org/wiki/Deoxycholic_acid
: option3: reducing alkylation kit for proteomics(it could be expensive as it
: handle tiny amount of proteins for mass spec)
: alkylating agent, iodoacetamide.
: option4: in gel protein fragmentation via chemical cleavage before blot
: transfer
: option1-----4 easiness of handling experiments decreased
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s******y
发帖数: 28562 | 35 让我试试看。。。
【在 i***l 的大作中提到】
: 蛋白胶Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ，
: 上 ５Ｍ Ｕｒｅａ ＋５％ＳＤＳ ＋０．５％ Ｂ－巯基乙醇， 煮沸？
: 膜蛋白不要煮沸，反而～４０度左右更好。
:
: 。。
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i*****g
发帖数: 11893 | 36 i know, the lane swells. no solution.
【在 s******y 的大作中提到】
: guanidine-HCL 浓度高的时候好像会严重影响跑胶的样子呢，我以前用6M
: guanidine 做出的样品跑起来严重拖带，这个问题怎么解决？
:
: it
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y******8
发帖数: 1764 | 37 second this, Urea + high b-ME should work.
【在 s******y 的大作中提到】
: 让我试试看。。。
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s******y
发帖数: 28562 | 38 谢谢！等试出结果来了一定来告诉大家：）
【在 y******8 的大作中提到】
: second this, Urea + high b-ME should work.
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f*******e
发帖数: 354 | 39 WB还好吧 SDS+bME 100度水煮一刻钟，蛋白应该都完全打开了吧 还会检不出来 ？
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们有一个蛋白，没有连GFP的时候很容易被一个抗体识别（肯定是特异信号，
: 因为有纯化蛋白，WT and KO control有非常好的识别），但是连上GFP之后就
: 没有识别了！换了另外一个抗体，也是一样结果！
: 大家遇到过这种情况么？我们的初步判断是这个GFP 因为有内部共价键，
: 所以不能被SDS完全变性，所以可能一大团东西摆在那里挡住了抗原位置。
: 这个该怎么处理？如果要做antigen retrieval怎么搞？
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m******5
发帖数: 1383 | 40 我请教个欠揍的问题啊……就一个啊…… 楼主确定你的蛋白功能正常么？
另外，如果GFP挡了抗原决定簇，为什么换另一个抗体也不行？
另外，楼主的GFP光谱正常么？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 41 功能肯定正常 （该fusion protein 无数人用过）
GFP光谱正常
不知道为什么换了抗体也不行，但是其中一个抗体是识别C-terminus附近的氨基酸，
正好是连接的地方,另外一个抗体是识别N-terminus附近的，不知道为什么也不行
【在 m******5 的大作中提到】
: 我请教个欠揍的问题啊……就一个啊…… 楼主确定你的蛋白功能正常么？
: 另外，如果GFP挡了抗原决定簇，为什么换另一个抗体也不行？
: 另外，楼主的GFP光谱正常么？
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m******5
发帖数: 1383 | 42 IF 情况怎么样？
我有一个好玩的建议：如果if也不work而细胞内功能又正常，就是一个很好的证据证明
那两个抗原决定簇不参与细胞内功能
如果if work |
