n***w
发帖数: 2405 | 1 GST-fusion protein,
bind完后用elution buffer洗出来了，然后pool，然后dialyze back to PBS (pH 7.3)
，dialyze完我测了下pH是7.56，然后加thrombin，切了一会儿就出现precipitation了
，根据我上次的经验，precipitates里面90%是我需要的蛋白。
现在一个问题是，为啥会有析出？我加完thrombin切的过程中测了一下pH，起码1个小
时的时候pH没有什么变化。。
所以想，是不是因为切了以后蛋白结构变了，疏水性增加？
这个116kD的fusion protein里有18个cysteine，结合之前有人发的帖子，我在想，是
不是这个原因？
谢谢。 |
s********n
发帖数: 2939 | 2 18个cysteine，估计有不少的disulfide bonds，你是表达在E. coli的cytoplasm？如
果是的话，misfold的可能性很大。GST增加了fusion的可溶性，切掉以后就沉淀了。 |
p****p
发帖数: 3360 | 3 这东西有时难搞定，能不切就别切。
3)
【在 n***w 的大作中提到】
: GST-fusion protein,
: bind完后用elution buffer洗出来了，然后pool，然后dialyze back to PBS (pH 7.3)
: ，dialyze完我测了下pH是7.56，然后加thrombin，切了一会儿就出现precipitation了
: ，根据我上次的经验，precipitates里面90%是我需要的蛋白。
: 现在一个问题是，为啥会有析出？我加完thrombin切的过程中测了一下pH，起码1个小
: 时的时候pH没有什么变化。。
: 所以想，是不是因为切了以后蛋白结构变了，疏水性增加？
: 这个116kD的fusion protein里有18个cysteine，结合之前有人发的帖子，我在想，是
: 不是这个原因？
: 谢谢。
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v**********m
发帖数: 5516 | 4 Sadly, the truth is that the protein you are working on is likely to
precipitate out by itself. The GST tag increases the solubility of the
fusion protein.
Man, doing protein expression is nothing more than gambling or trading stocks.
割肉吧。
3)
【在 n***w 的大作中提到】
: GST-fusion protein,
: bind完后用elution buffer洗出来了，然后pool，然后dialyze back to PBS (pH 7.3)
: ，dialyze完我测了下pH是7.56，然后加thrombin，切了一会儿就出现precipitation了
: ，根据我上次的经验，precipitates里面90%是我需要的蛋白。
: 现在一个问题是，为啥会有析出？我加完thrombin切的过程中测了一下pH，起码1个小
: 时的时候pH没有什么变化。。
: 所以想，是不是因为切了以后蛋白结构变了，疏水性增加？
: 这个116kD的fusion protein里有18个cysteine，结合之前有人发的帖子，我在想，是
: 不是这个原因？
: 谢谢。
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s******y
发帖数: 28562 | 5 我赞同这个说法。
the
【在 v**********m 的大作中提到】
: Sadly, the truth is that the protein you are working on is likely to
: precipitate out by itself. The GST tag increases the solubility of the
: fusion protein.
: Man, doing protein expression is nothing more than gambling or trading stocks.
: 割肉吧。
:
: 3)
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s*******e
发帖数: 1010 | 6 换个真核的表达体系吧，或许会对folding有帮助，当然前提是值得这么去试 |
n***w
发帖数: 2405 | |
