n******2
发帖数: 971 | 1 1、如何判断DNA-Protein 被over cross linking 还是under cross linking？
2、在sonication的优化过程中，0次sonication的DNA 总是有smear。我用的是MCF7
cell line，第一步就用1% Formaldehyde固定，然后大体是harvest=>lysis=>sonicate
=>reverse=>proteanaseK=>DNA purification。DNA降解最可能会在哪一步呢？
3、如果用histone检验实验体系，如何选择DNA binding region?
谢了。 |
k*****n
发帖数: 323 | 2 1：1% formaldehyde crosslink 10-20min 应该都不会有太大问题。
2：理论上dna哪一步都不会降解。除非你有dnase的污染。
3：单纯的histone不是很好的检验体系，你可以用polii和h3k4me3或者h3ac的抗体做系
统的阳性对照。 |
d****7
发帖数: 109 | 3 2 可不一定。如果不用qiagen kit回收dna，而用phenol回收的话，phenol的pH有时候
会变低，低
pH会讲解DNA
【在 k*****n 的大作中提到】
: 1：1% formaldehyde crosslink 10-20min 应该都不会有太大问题。
: 2：理论上dna哪一步都不会降解。除非你有dnase的污染。
: 3：单纯的histone不是很好的检验体系，你可以用polii和h3k4me3或者h3ac的抗体做系
: 统的阳性对照。
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d****7
发帖数: 109 | 4 1。做time-course，跑western blot，能在IP下看见蛋白的范围大概就行，然后做PCR
优化
2。不用纠结0次sonication，我从来不跑0 sonication的
3。看别人用啥region
sonicate
【在 n******2 的大作中提到】
: 1、如何判断DNA-Protein 被over cross linking 还是under cross linking？
: 2、在sonication的优化过程中，0次sonication的DNA 总是有smear。我用的是MCF7
: cell line，第一步就用1% Formaldehyde固定，然后大体是harvest=>lysis=>sonicate
: =>reverse=>proteanaseK=>DNA purification。DNA降解最可能会在哪一步呢？
: 3、如果用histone检验实验体系，如何选择DNA binding region?
: 谢了。
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n******2
发帖数: 971 | 5 1、我用的是pcr纯化试剂盒回收dna.
2、0 sonication 的smear有没有可能是RNA?各位在优化sonication的条件时用RNase处
理DNA吗？
3、sonication中，我采用最小功率（大功率极易产生bubble）并依次增加次数的方法
进行优化体系，但始终能在胶上看到有大片段DNA的存在。这是什么原因？sonicate次
数不够(目前已经提高到20多次，15s/pulse)? 还是over cross linking(10min)? |
z*******a
发帖数: 175 | 6 one more ChIP person, I would avoid ChIP whenever I can.
my comments on your questions.
0 sonication 的smear是RNA, 用RNase处理DNA is necessary
over fixed or sonicator is broken |
a****o
发帖数: 1786 | 7 1. Optimal crossing has a wide range, usually it does not matter, check
published paper for a reasonable time.
2. You need treat your sample with RNase before running on agarose gel,
otherwise most you see is RNA
3. Promoters are generally depleted of histone and coding regions have high
level of histone. It is not a good choice to use histone. You can detect
histone association even without crossing.
sonicate
【在 n******2 的大作中提到】
: 1、如何判断DNA-Protein 被over cross linking 还是under cross linking？
: 2、在sonication的优化过程中，0次sonication的DNA 总是有smear。我用的是MCF7
: cell line，第一步就用1% Formaldehyde固定，然后大体是harvest=>lysis=>sonicate
: =>reverse=>proteanaseK=>DNA purification。DNA降解最可能会在哪一步呢？
: 3、如果用histone检验实验体系，如何选择DNA binding region?
: 谢了。
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k*****n
发帖数: 323 | 8 你别告诉我你没reverse crosslink就直接跑dna胶了 |
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