a*******u
发帖数: 19 | 1 GST-fused protein A 拉下了B,C,D.且ABCD在胞浆和核内都有分布。文献报道BC、BD在
胞浆和核内都有直接的相互作用，但BCD是否在一个复合物未知或未报道。现在猜想
ABCD很有可能在一个复合物，A作为一个scaffold protein的角色。有什么方法说明4个
蛋白或者至少3个蛋白形成一个complex？有没有比较简单点的方法，国内实验室的设备
条件比较限制。 |
L********g
发帖数: 4204 | 2 do you have antibody against B C D ( I suppose you have or at least B C D
have tags), your GST results have somehow support your hypothesis, so you
can add some more evidence
1)co-IP, give in vivo evidence (need tagged A expressed in cells)
2) gel-filtration(size exlusive column) using FPLC, check their
cofractionation status, if they all comes out at the same fractions (peaks
overlap). This may require equipment and buy columns. |
a*******u
发帖数: 19 | 3 co-IP results also show A has interaction with B or C or D.
gel-filtration seems fine, but the equipment is a problem.
【在 L********g 的大作中提到】
: do you have antibody against B C D ( I suppose you have or at least B C D
: have tags), your GST results have somehow support your hypothesis, so you
: can add some more evidence
: 1)co-IP, give in vivo evidence (need tagged A expressed in cells)
: 2) gel-filtration(size exlusive column) using FPLC, check their
: cofractionation status, if they all comes out at the same fractions (peaks
: overlap). This may require equipment and buy columns.
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l*******1
发帖数: 128 | 4 I think you might need to do consecutive affinity column/pull down. Let's
say you tag your A, B, C, D with GST, V5, His, and HA.
You can start with GST-fused A to pull down the A-containing complexes.
Then pass the elution to V5-tag beads, elute the presumed A&B containing
complexes with V5 peptide. Pass the A&B containing complexes through His-
tag beads, elute the ABC complex with imidazole.
Use Western to probe the original sample and each elution for those 4 tags.
Of course, you can change the order of affinity purification to further
confirm it.
【在 a*******u 的大作中提到】
: GST-fused protein A 拉下了B,C,D.且ABCD在胞浆和核内都有分布。文献报道BC、BD在
: 胞浆和核内都有直接的相互作用，但BCD是否在一个复合物未知或未报道。现在猜想
: ABCD很有可能在一个复合物，A作为一个scaffold protein的角色。有什么方法说明4个
: 蛋白或者至少3个蛋白形成一个complex？有没有比较简单点的方法，国内实验室的设备
: 条件比较限制。
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D******9
发帖数: 2665 | 5 you have to separate the protein complex(es) by FPLC, then check the
component of different fractions. |
l*******1
发帖数: 128 | 6 With gel filtration, how can you rule out the possibility where different
combinations of those four proteins might belong to different complexes and
those complexes happen to have same molecular weight?
【在 a*******u 的大作中提到】
: co-IP results also show A has interaction with B or C or D.
: gel-filtration seems fine, but the equipment is a problem.
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c******r
发帖数: 3778 | 7 1.co-IP
2.试试看nondenature gel，probe with anti-A，B，C，D，运气好的话能够显示一条
band
3.co-localization。immunofluorescent应该显示overlap。
4.特殊情况下，可以用更复杂的FRET啥的。
【在 a*******u 的大作中提到】
: GST-fused protein A 拉下了B,C,D.且ABCD在胞浆和核内都有分布。文献报道BC、BD在
: 胞浆和核内都有直接的相互作用，但BCD是否在一个复合物未知或未报道。现在猜想
: ABCD很有可能在一个复合物，A作为一个scaffold protein的角色。有什么方法说明4个
: 蛋白或者至少3个蛋白形成一个complex？有没有比较简单点的方法，国内实验室的设备
: 条件比较限制。
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L********g
发帖数: 4204 | 8 agree, gel-filtratioin has its limit, thats why I list it on option 2 only
to add some more evidence to the GST, co-IP results.
But if A/B is the hub/scaffold, mutated A/B or KO AB may cause the
disassoation of B C D, then you will see differnt gel-filtration profilings.
through this comparison, you can say A/others are important for forming a
complex.
Also for linyijvn1, have you done some genetic analysis to add evidence that
A, B, C, D are depending on each other for functions? Personally I think
GST and co-IP results can be good enough to give some biochemical evidences.
you just need other aspects (e.g. genetic interactions or co-localization
and
【在 l*******1 的大作中提到】
: With gel filtration, how can you rule out the possibility where different
: combinations of those four proteins might belong to different complexes and
: those complexes happen to have same molecular weight?
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I*********r
发帖数: 8 | 9 try crosslinking (maybe followed by mass spec)
【在 a*******u 的大作中提到】
: GST-fused protein A 拉下了B,C,D.且ABCD在胞浆和核内都有分布。文献报道BC、BD在
: 胞浆和核内都有直接的相互作用，但BCD是否在一个复合物未知或未报道。现在猜想
: ABCD很有可能在一个复合物，A作为一个scaffold protein的角色。有什么方法说明4个
: 蛋白或者至少3个蛋白形成一个complex？有没有比较简单点的方法，国内实验室的设备
: 条件比较限制。
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D*a
发帖数: 6830 | |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 Native gel and sucrose gradient centrifugation
【在 a*******u 的大作中提到】
: GST-fused protein A 拉下了B,C,D.且ABCD在胞浆和核内都有分布。文献报道BC、BD在
: 胞浆和核内都有直接的相互作用，但BCD是否在一个复合物未知或未报道。现在猜想
: ABCD很有可能在一个复合物，A作为一个scaffold protein的角色。有什么方法说明4个
: 蛋白或者至少3个蛋白形成一个complex？有没有比较简单点的方法，国内实验室的设备
: 条件比较限制。
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e****s
发帖数: 1125 | 12 你的Pulldown结果表示这些是一个大的Complex，
这可能会是一个比较复杂点的课题。只要A和BCD中任何一个有Interaction，都可能把3
个蛋白都拉下来。甚至还有其他的Player,因此理论上，A和BCD都不结合甚至都可能把
他们拉下来。
要是我，我会先盯着A和B做。最好的办法是用Purified protein来PD，也只有这样才能
证明是direct interaction。因为你在in vivo能把B拉下来，所以如果AB是直接相互作
用的话，在In vitro，应该也能PD下来。
【在 a*******u 的大作中提到】
: GST-fused protein A 拉下了B,C,D.且ABCD在胞浆和核内都有分布。文献报道BC、BD在
: 胞浆和核内都有直接的相互作用，但BCD是否在一个复合物未知或未报道。现在猜想
: ABCD很有可能在一个复合物，A作为一个scaffold protein的角色。有什么方法说明4个
: 蛋白或者至少3个蛋白形成一个complex？有没有比较简单点的方法，国内实验室的设备
: 条件比较限制。
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H*g
发帖数: 2333 | 13 For 3 proteins, you may try BiFC-FRET for in vivo and real-time interaction
analysis. |
s********n
发帖数: 2939 | |
a*******u
发帖数: 19 | 15 多谢建议，已经进行A和B的mapping了，比较繁琐，也不不太顺。
把3
【在 e****s 的大作中提到】
: 你的Pulldown结果表示这些是一个大的Complex，
: 这可能会是一个比较复杂点的课题。只要A和BCD中任何一个有Interaction，都可能把3
: 个蛋白都拉下来。甚至还有其他的Player,因此理论上，A和BCD都不结合甚至都可能把
: 他们拉下来。
: 要是我，我会先盯着A和B做。最好的办法是用Purified protein来PD，也只有这样才能
: 证明是direct interaction。因为你在in vivo能把B拉下来，所以如果AB是直接相互作
: 用的话，在In vitro，应该也能PD下来。
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a*******u
发帖数: 19 | 16 thanks a lot.
Any reference papers or protocols recommended?
I have no experiences on protein affinity purification.
.
【在 l*******1 的大作中提到】
: I think you might need to do consecutive affinity column/pull down. Let's
: say you tag your A, B, C, D with GST, V5, His, and HA.
: You can start with GST-fused A to pull down the A-containing complexes.
: Then pass the elution to V5-tag beads, elute the presumed A&B containing
: complexes with V5 peptide. Pass the A&B containing complexes through His-
: tag beads, elute the ABC complex with imidazole.
: Use Western to probe the original sample and each elution for those 4 tags.
: Of course, you can change the order of affinity purification to further
: confirm it.
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a*******u
发帖数: 19 | 17 CFP,YFP,GFP,RFP tagged protein去做confocal，但我的师姐说那样也不太令人信服不
能算是直接的证据。
不明白更复杂FRET怎么做，只知道CFP and YFP能做直接的相互作用，但是即使两两的
相互作用也不能说明3个或3个以上在一起，两个之间可以有竞争性排他占据的作用。
nondenaturation gel，能不能给个paper和protocol，听起来如果运气好的话，就能做
出来，而且成本或比较低。
【在 c******r 的大作中提到】
: 1.co-IP
: 2.试试看nondenature gel，probe with anti-A，B，C，D，运气好的话能够显示一条
: band
: 3.co-localization。immunofluorescent应该显示overlap。
: 4.特殊情况下，可以用更复杂的FRET啥的。
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e****s
发帖数: 1125 | 18 这个有点太复杂了。
3-4步的Pull-down，Separation time 会很长。而且没一步骤换不同的Beads PD，如果
相互间的Kd不是ng级别的，我相信很少的蛋白会残留在最后的Eluate里面。
而且我认为，这个做法和楼主直接PD检测到3个Binding partners的结果没有实质性的
区别。
.
【在 l*******1 的大作中提到】
: I think you might need to do consecutive affinity column/pull down. Let's
: say you tag your A, B, C, D with GST, V5, His, and HA.
: You can start with GST-fused A to pull down the A-containing complexes.
: Then pass the elution to V5-tag beads, elute the presumed A&B containing
: complexes with V5 peptide. Pass the A&B containing complexes through His-
: tag beads, elute the ABC complex with imidazole.
: Use Western to probe the original sample and each elution for those 4 tags.
: Of course, you can change the order of affinity purification to further
: confirm it.
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p*l
发帖数: 1359 | 19 there is no way to do a four part complex FRET as of now. It is an optical
instrument research problem. Current
microscopes just can't give you enough information to analyze FRET between
so many labels. You can try one pair
FRET at a time. But again what you get are not direct evidences of a four
part complex.
【在 a*******u 的大作中提到】
: CFP,YFP,GFP,RFP tagged protein去做confocal，但我的师姐说那样也不太令人信服不
: 能算是直接的证据。
: 不明白更复杂FRET怎么做，只知道CFP and YFP能做直接的相互作用，但是即使两两的
: 相互作用也不能说明3个或3个以上在一起，两个之间可以有竞争性排他占据的作用。
: nondenaturation gel，能不能给个paper和protocol，听起来如果运气好的话，就能做
: 出来，而且成本或比较低。
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y********g
发帖数: 22 | 20 treat the proteinA pd with trypsin digestion, then determine the mass of
fragments by mass spec. if bcd are not too big, chances are you can map the
sequence of each component. even the map is incomplete, you;ll still know if
the pd contains b, c or d. |
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i*****g
发帖数: 11893 | 21 这玩意挺啰嗦的，要做一堆实验，
完全靠co-IP 有假阳性
更麻烦的是，你证明了他们在一个complex里面，功能呢？ 没有功能（也就是所谓：
making story）怎么发文章？ |
c*****d
发帖数: 50 | 22 There are known interactions between BC and BD. You may only have to prove C
+D in vivo with FRET. For in vitro, How about 2d gel separation. |
c******r
发帖数: 3778 | 23 sure，师姐说得对啊。但是colocalization是充分非必要的。所以算supportive
evidence。
一个 一个coIP吧，最直接证据
【在 a*******u 的大作中提到】
: CFP,YFP,GFP,RFP tagged protein去做confocal，但我的师姐说那样也不太令人信服不
: 能算是直接的证据。
: 不明白更复杂FRET怎么做，只知道CFP and YFP能做直接的相互作用，但是即使两两的
: 相互作用也不能说明3个或3个以上在一起，两个之间可以有竞争性排他占据的作用。
: nondenaturation gel，能不能给个paper和protocol，听起来如果运气好的话，就能做
: 出来，而且成本或比较低。
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t****p
发帖数: 1504 | 24 这个不可行。crosslink的效率挺低的，要把一个4蛋白的complex连在一起是几乎不可
能的。
【在 I*********r 的大作中提到】
: try crosslinking (maybe followed by mass spec)
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n****n
发帖数: 434 | 25 IP-MS
the
if
【在 y********g 的大作中提到】
: treat the proteinA pd with trypsin digestion, then determine the mass of
: fragments by mass spec. if bcd are not too big, chances are you can map the
: sequence of each component. even the map is incomplete, you;ll still know if
: the pd contains b, c or d.
|
p****p
发帖数: 3360 | 26 What if what you've IPed has many complexes.
【在 n****n 的大作中提到】
: IP-MS
:
: the
: if
|
h********n
发帖数: 4079 | 27 do you mean IP then ESI?
【在 n****n 的大作中提到】
: IP-MS
:
: the
: if
|
e*******0
发帖数: 1487 | 28 这个想法不太现实，因为这样复杂的蛋白质复合体是需要很长时间和很多实验来证实的
。lz即便是硬做出一些实验结果，也很难发表。最现实的做法是，找出其中最容易检测
功能的蛋白，通过研究其余四个蛋白对目的蛋白功能的影响来说明其生物学意义。仅仅
证明蛋白质之间的物理结合是不能说明任何问题的，而且也是不适合用生物学方法在一
篇文章的工作量范围证明其全部。lz可以参考一下转录复合体的研究历史，看看自己能
不能一个人完成数十个实验室十几年的工作量。 |
