z***q
发帖数: 907 | 1 一个小的hairpin loop(27nt),用核磁做其结构。在水中看base pair(imino-imino,
imino-amino),folding correctly, connectivity也很多，但是5-8ppm的peaks are
totally
messed up, very broad and not well resolved.换到D2O中也是一样，即使2D
expperiemnts, 也不能很好的区分各个峰。1D上就像一个大的馒头峰，上面插着若干个
小叉子
（小尖峰）一样，无法分开各个峰。
像请问各位大侠，有人遇到过这种情况么？这个RNA 到底有没有正确折叠呢？从非变性
胶上只
看到一条清晰的条带，确定是monomer而不是dimer.如果结构不对的话，有什么方法可
以使其
正确折叠呢？我已经试过了加热快速冷却，缓慢冷却，改变盐离子浓度（50mM,100mM),
pH值
（试过4.5，6.0）都不管用，而且每次得到的谱图（1D）都不一样，都快被它搞崩溃了
。是不
是接下去只能考虑换序列了？老板也完全不能理解这种情况，只是反复和我强调我的操
作有错
误，他这么多年从来没有遇到过这种情况等等。
非常感谢各位! |
x*****o
发帖数: 441 | 2 不是太懂NMR,不知道你的核磁结果的解释是什么.
你的hairpin stem是不是GC rich,会不会没有闭合.你的Tm是多少?
还有non-denaturing gel 怎么确定不是dimer?
【在 z***q 的大作中提到】
: 一个小的hairpin loop(27nt),用核磁做其结构。在水中看base pair(imino-imino,
: imino-amino),folding correctly, connectivity也很多，但是5-8ppm的peaks are
: totally
: messed up, very broad and not well resolved.换到D2O中也是一样，即使2D
: expperiemnts, 也不能很好的区分各个峰。1D上就像一个大的馒头峰，上面插着若干个
: 小叉子
: （小尖峰）一样，无法分开各个峰。
: 像请问各位大侠，有人遇到过这种情况么？这个RNA 到底有没有正确折叠呢？从非变性
: 胶上只
: 看到一条清晰的条带，确定是monomer而不是dimer.如果结构不对的话，有什么方法可
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z***q
发帖数: 907 | 3 谢谢回复！
结果的解释就是所有supposed base pairs都形成了，hairpin stem有9个base pairs,
只有2个GC，Tm没测过，算出来的是54C，自由能也很低，因为序列开始是2个UU base
pair，可能不太稳定，但是从核磁上看UU base pair都形成了，所以感觉很矛盾。试过
端基变成GC,然后就发现了很多dimer.non-denaturing gel上是根据别的已知样品的对
照。
【在 x*****o 的大作中提到】
: 不是太懂NMR,不知道你的核磁结果的解释是什么.
: 你的hairpin stem是不是GC rich,会不会没有闭合.你的Tm是多少?
: 还有non-denaturing gel 怎么确定不是dimer?
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x*****o
发帖数: 441 | 4 我觉得可能是有很多dynamics, 结构不稳定. 你看到到的有可能有好几个comformation
的混合物. RNA的结构很多变,dynamics是特点.
看看能不能再多加点一价金属,稳定一下结构.其实稳定结构镁离子最好,但是听说NMR不
能用镁.
【在 z***q 的大作中提到】
: 谢谢回复！
: 结果的解释就是所有supposed base pairs都形成了，hairpin stem有9个base pairs,
: 只有2个GC，Tm没测过，算出来的是54C，自由能也很低，因为序列开始是2个UU base
: pair，可能不太稳定，但是从核磁上看UU base pair都形成了，所以感觉很矛盾。试过
: 端基变成GC,然后就发现了很多dimer.non-denaturing gel上是根据别的已知样品的对
: 照。
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s***m
发帖数: 6197 | 5
comformation
没这个说法。Mg2+这么重要的阳离子怎么可能不用。
【在 x*****o 的大作中提到】
: 我觉得可能是有很多dynamics, 结构不稳定. 你看到到的有可能有好几个comformation
: 的混合物. RNA的结构很多变,dynamics是特点.
: 看看能不能再多加点一价金属,稳定一下结构.其实稳定结构镁离子最好,但是听说NMR不
: 能用镁.
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T**********t
发帖数: 1604 | 6 Ambion的网站上说镁离子的存在会让RNA产生非特异性降解：
http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_159.html
不过我们实验室确实也用含Mg的buffer做过RNA的NMR就是了。可惜我不做NMR，lz的问
题我答不上来。
【在 s***m 的大作中提到】
:
: comformation
: 没这个说法。Mg2+这么重要的阳离子怎么可能不用。
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x*****o
发帖数: 441 | 7 和很多做RNA NMR的谈过,镁离子浓度过高会使谱图看起来很差,所以他们使用不超过5mM
. 要是想要稳定RNA结构,在buffer里面至少需要10mM.
你是做RNA NMR的?你平时用什么浓度?
【在 s***m 的大作中提到】
:
: comformation
: 没这个说法。Mg2+这么重要的阳离子怎么可能不用。
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r********d
发帖数: 58 | 8 hehe,多重构象
把盐脱掉
buffer用5个mM就可以了
【在 z***q 的大作中提到】
: 一个小的hairpin loop(27nt),用核磁做其结构。在水中看base pair(imino-imino,
: imino-amino),folding correctly, connectivity也很多，但是5-8ppm的peaks are
: totally
: messed up, very broad and not well resolved.换到D2O中也是一样，即使2D
: expperiemnts, 也不能很好的区分各个峰。1D上就像一个大的馒头峰，上面插着若干个
: 小叉子
: （小尖峰）一样，无法分开各个峰。
: 像请问各位大侠，有人遇到过这种情况么？这个RNA 到底有没有正确折叠呢？从非变性
: 胶上只
: 看到一条清晰的条带，确定是monomer而不是dimer.如果结构不对的话，有什么方法可
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r********d
发帖数: 58 | 9 如果9个base pair中只有两个GC的话，那你的这个结构肯定不稳定
【在 z***q 的大作中提到】
: 谢谢回复！
: 结果的解释就是所有supposed base pairs都形成了，hairpin stem有9个base pairs,
: 只有2个GC，Tm没测过，算出来的是54C，自由能也很低，因为序列开始是2个UU base
: pair，可能不太稳定，但是从核磁上看UU base pair都形成了，所以感觉很矛盾。试过
: 端基变成GC,然后就发现了很多dimer.non-denaturing gel上是根据别的已知样品的对
: 照。
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z***q
发帖数: 907 | 10 非常感谢！
NMR可以用镁，但是浓度不能太高，因为镁可以broadern peaks.至于降解，只要温度低
于30C应该没有太大问题。
但是，想请问一下，如果没有已知的镁binding site,generally 镁仍可以稳定结构么？
非常感谢！
comformation
【在 x*****o 的大作中提到】
: 我觉得可能是有很多dynamics, 结构不稳定. 你看到到的有可能有好几个comformation
: 的混合物. RNA的结构很多变,dynamics是特点.
: 看看能不能再多加点一价金属,稳定一下结构.其实稳定结构镁离子最好,但是听说NMR不
: 能用镁.
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z***q
发帖数: 907 | 11 非常感谢!
请问你说buffer用5个mM是指5mM NaCl? 盐离子不是用来稳定结构的么？为什么脱盐后
反而可以改善多重构向呢？
谢谢！
【在 r********d 的大作中提到】
: hehe,多重构象
: 把盐脱掉
: buffer用5个mM就可以了
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z***q
发帖数: 907 | 12 感觉结构是不太稳定，因为20C以上峰就更broad,完全成了馒头，连小叉子都看不见了。
但是为什么在imino region看不出多重构向呢？主要是imino region太好了，搞得老板
总是不想放弃，就说我做得不对，但他也不知道哪里不对。
请问现在只有改序列这一种办法了么？
【在 r********d 的大作中提到】
: 如果9个base pair中只有两个GC的话，那你的这个结构肯定不稳定
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z***q
发帖数: 907 | 13 对的，镁离子浓度过高会使谱图看起来很差，所以一般不会超过5mM
但是，请问“要是想要稳定RNA结构,在buffer里面至少需要10mM”这个是对于任何浓度
的RNA都适用的么？
谢谢！
5mM
【在 x*****o 的大作中提到】
: 和很多做RNA NMR的谈过,镁离子浓度过高会使谱图看起来很差,所以他们使用不超过5mM
: . 要是想要稳定RNA结构,在buffer里面至少需要10mM.
: 你是做RNA NMR的?你平时用什么浓度?
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r********d
发帖数: 58 | 14 盐浓度越高，越有利于稳定dimer,trimer等结构
盐浓度低一点对single hairpin好
你干脆别加盐了，如果buffer是用phosphate来控制pH的话，那么加5mM的phosphate就
可以了
你sample concentration是多少？
【在 z***q 的大作中提到】
: 非常感谢!
: 请问你说buffer用5个mM是指5mM NaCl? 盐离子不是用来稳定结构的么？为什么脱盐后
: 反而可以改善多重构向呢？
: 谢谢！
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r********d
发帖数: 58 | 15 在结构末端多加两个basepair,把结构稳定下来
同时把盐脱掉，防止dimer的形成
再就是做NMR之前用heat and fast cool,不过个人感觉这个没啥帮助
了。
【在 z***q 的大作中提到】
: 感觉结构是不太稳定，因为20C以上峰就更broad,完全成了馒头，连小叉子都看不见了。
: 但是为什么在imino region看不出多重构向呢？主要是imino region太好了，搞得老板
: 总是不想放弃，就说我做得不对，但他也不知道哪里不对。
: 请问现在只有改序列这一种办法了么？
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r********d
发帖数: 58 | 16 在25度的时候，imnino region还好吗？
了。
【在 z***q 的大作中提到】
: 感觉结构是不太稳定，因为20C以上峰就更broad,完全成了馒头，连小叉子都看不见了。
: 但是为什么在imino region看不出多重构向呢？主要是imino region太好了，搞得老板
: 总是不想放弃，就说我做得不对，但他也不知道哪里不对。
: 请问现在只有改序列这一种办法了么？
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x*****o
发帖数: 441 | 17 Mg 有效的中和RNA backbone 的负电荷,可以稳定二,三级结构. Na或者K没有Mg有效,
一般认为稳定的是RNA的二级结构.如果在没有镁的情况下,大量的单价离子 (1M)可以减
少 non-specific binding,稳定特定的conformation. 但是不知道NMR是不是不能用大
量的单价离子.
我们实验室以前也用hairpin(虽然不是核磁)hairpin ribozyme, 但是觉得mg 在10mM
的时候效果最好.
我以前有朋友做RNA NMR, 也是hairpin,不过他们的stem是GC rich的,比较稳定.
【在 z***q 的大作中提到】
: 对的，镁离子浓度过高会使谱图看起来很差，所以一般不会超过5mM
: 但是，请问“要是想要稳定RNA结构,在buffer里面至少需要10mM”这个是对于任何浓度
: 的RNA都适用的么？
: 谢谢！
:
: 5mM
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s***m
发帖数: 6197 | 18 同意rutherford的说法
你按他的建议试试看先
～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
这个是要在不形成dimer的前提下
10mM
【在 x*****o 的大作中提到】
: Mg 有效的中和RNA backbone 的负电荷,可以稳定二,三级结构. Na或者K没有Mg有效,
: 一般认为稳定的是RNA的二级结构.如果在没有镁的情况下,大量的单价离子 (1M)可以减
: 少 non-specific binding,稳定特定的conformation. 但是不知道NMR是不是不能用大
: 量的单价离子.
: 我们实验室以前也用hairpin(虽然不是核磁)hairpin ribozyme, 但是觉得mg 在10mM
: 的时候效果最好.
: 我以前有朋友做RNA NMR, 也是hairpin,不过他们的stem是GC rich的,比较稳定.
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z***q
发帖数: 907 | 19 非常感谢你的建议！
我们实验室现在一般不用phosphate，直接用H2O+NaCl,然后pH the sample,据说得到的
谱图比较好，所以我从来没有试过加phosphate。
不过这样做可能的确有问题，pH 也不太准，我试试用5mM的phosphate，不加盐离子看
看吧
sample concentration 大约0.9-1mM.
请问这个浓度能做natural-abundance N15-HSQC么？
非常感谢！
【在 r********d 的大作中提到】
: 盐浓度越高，越有利于稳定dimer,trimer等结构
: 盐浓度低一点对single hairpin好
: 你干脆别加盐了，如果buffer是用phosphate来控制pH的话，那么加5mM的phosphate就
: 可以了
: 你sample concentration是多少？
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z***q
发帖数: 907 | 20 不好了。
不过即使稳定的结构，imino到了25度也会因为fast exchange 看不到了吧？
【在 r********d 的大作中提到】
: 在25度的时候，imnino region还好吗？
:
: 了。
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|
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z***q
发帖数: 907 | 21 就是说结构不稳定主要是端基没有GC的原因了？
我曾经做过一个mutation,就是把端基的2个UU都去掉，再把邻近UU的AU变成GC，这样就
有2个GC连在一起，可以transcribe了。然后发现得到的样品dimer有大概30%-40%，这
是不是说明不仅stem,其实loop也不稳定？
非常感谢！
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
这个我感觉也没什么用
【在 r********d 的大作中提到】
: 在结构末端多加两个basepair,把结构稳定下来
: 同时把盐脱掉，防止dimer的形成
: 再就是做NMR之前用heat and fast cool,不过个人感觉这个没啥帮助
:
: 了。
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z***q
发帖数: 907 | 22 恩，谢谢回复
【在 s***m 的大作中提到】
: 同意rutherford的说法
: 你按他的建议试试看先
:
: ～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
: 这个是要在不形成dimer的前提下
: 10mM
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r********d
发帖数: 58 | 23 我觉得15N实验悬
不过可以试试吗，呵呵
pH还是要控制的，一般都是用buffer控制，不明白你说pH the sample是什么意思？
【在 z***q 的大作中提到】
: 非常感谢你的建议！
: 我们实验室现在一般不用phosphate，直接用H2O+NaCl,然后pH the sample,据说得到的
: 谱图比较好，所以我从来没有试过加phosphate。
: 不过这样做可能的确有问题，pH 也不太准，我试试用5mM的phosphate，不加盐离子看
: 看吧
: sample concentration 大约0.9-1mM.
: 请问这个浓度能做natural-abundance N15-HSQC么？
: 非常感谢！
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r********d
发帖数: 58 | 24 那真是不稳定啊，呵呵
举个例子，DNA双螺旋的imino你到40度可能都还看得到，就因为这个结构非常稳定，呵呵
【在 z***q 的大作中提到】
: 不好了。
: 不过即使稳定的结构，imino到了25度也会因为fast exchange 看不到了吧？
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r********d
发帖数: 58 | 25 这个问题要分两重看
第一，你加了GC之后，hirpin是比原来稳定了
第二，你加了GC之后新的序列形成的dimer可能比single hairpin更稳定，这个就和序
列有关了，没拿到结构，谁也说不太清楚，呵呵
【在 z***q 的大作中提到】
: 就是说结构不稳定主要是端基没有GC的原因了？
: 我曾经做过一个mutation,就是把端基的2个UU都去掉，再把邻近UU的AU变成GC，这样就
: 有2个GC连在一起，可以transcribe了。然后发现得到的样品dimer有大概30%-40%，这
: 是不是说明不仅stem,其实loop也不稳定？
: 非常感谢！
:
: ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
: 这个我感觉也没什么用
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z***q
发帖数: 907 | 26 非常感谢你的回复！
pH the sample就是调样品的pH值啊，直接用NaOH,调到6左右。据说磷酸盐也会使谱图
变差，我没有试过。
【在 r********d 的大作中提到】
: 我觉得15N实验悬
: 不过可以试试吗，呵呵
: pH还是要控制的，一般都是用buffer控制，不明白你说pH the sample是什么意思？
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z***q
发帖数: 907 | 27 哦，长见识了，从来没有试过40C。。。。。
呵呵
【在 r********d 的大作中提到】
: 那真是不稳定啊，呵呵
: 举个例子，DNA双螺旋的imino你到40度可能都还看得到，就因为这个结构非常稳定，呵呵
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z***q
发帖数: 907 | 28 恩，你说的很有道理
感觉RNA的结构基本上由序列决定了，序列不行，怎么做都不行。。
再次感谢你的回复，给你发个包子吧
【在 r********d 的大作中提到】
: 这个问题要分两重看
: 第一，你加了GC之后，hirpin是比原来稳定了
: 第二，你加了GC之后新的序列形成的dimer可能比single hairpin更稳定，这个就和序
: 列有关了，没拿到结构，谁也说不太清楚，呵呵
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