c****9
发帖数: 95 | 1 我正在做一种固氮菌的酶切。chromosome材料应该没问题的，quantification是200ng/
ul.所以我用了5ul的chromosome, 1ul EcoR1， 4ul Eco buffer， 30ul diH2O.再分开
入4个小试管里面，保存在37度的水浴里面分别5MIN, 30MIN, 1H, 2H,然后移入65度的
水浴30分钟，再跑胶，但是做了2次，发现DNA都没有被切开。然后换了HindIII和NEB
Buffer2,结果也是没有切开。请教各位这个是哪个环节出问题了呢？是否有更好的办法
做酶切呢？谢谢。 | k*******c
发帖数: 142 | | c****9
发帖数: 95 | 3 Thanks. What's the meaning of O/N? | T**********t
发帖数: 1604 | | c****9
发帖数: 95 | | m*********7
发帖数: 606 | 6 首先，你有没有确定这个菌的chromosome有多大？有没有你这两个酶的酶切位点？
其次，按照识别位点6个碱基来算，4096个bp才能随机出现一个EcoRI的位点，考虑正反
向的话减一半就是2048bp。你跑胶的浓度是否合适来区分切开和没切开的状态？
你的描述中并没有出现非酶切对照，你是如何判断没切开的？
另外，你的实验目的是什么？为啥要用这两个酶来切？ | n***w
发帖数: 2405 | 7 是的～
【在 c****9 的大作中提到】
: 请问是放在水浴37度里面通宵吗？谢谢
| s********s
发帖数: 67 | 8 一般来说chromosome DNA overnight切完应该是smear。
200ng/
【在 c****9 的大作中提到】
: 我正在做一种固氮菌的酶切。chromosome材料应该没问题的，quantification是200ng/
: ul.所以我用了5ul的chromosome, 1ul EcoR1， 4ul Eco buffer， 30ul diH2O.再分开
: 入4个小试管里面，保存在37度的水浴里面分别5MIN, 30MIN, 1H, 2H,然后移入65度的
: 水浴30分钟，再跑胶，但是做了2次，发现DNA都没有被切开。然后换了HindIII和NEB
: Buffer2,结果也是没有切开。请教各位这个是哪个环节出问题了呢？是否有更好的办法
: 做酶切呢？谢谢。
| s******s
发帖数: 13035 | 9 什么叫做chromosome应该没有问题？phenol再抽一遍再切看看
200ng/
【在 c****9 的大作中提到】
: 我正在做一种固氮菌的酶切。chromosome材料应该没问题的，quantification是200ng/
: ul.所以我用了5ul的chromosome, 1ul EcoR1， 4ul Eco buffer， 30ul diH2O.再分开
: 入4个小试管里面，保存在37度的水浴里面分别5MIN, 30MIN, 1H, 2H,然后移入65度的
: 水浴30分钟，再跑胶，但是做了2次，发现DNA都没有被切开。然后换了HindIII和NEB
: Buffer2,结果也是没有切开。请教各位这个是哪个环节出问题了呢？是否有更好的办法
: 做酶切呢？谢谢。
| k*******s
发帖数: 214 | 10 gDNA酶切有几个注意事项
1. gDNA一定要干净，质量好。酶切之前要跑胶看看。
2. 酶切体积要大些，1ug的要50uL体积更好
3. 酶要多加些，一般要总体积的5%
4. 酶切反应时间可以延长到overnight. 一般在反应几个小时后，可以再加几ul酶继
续切。
5. 最后跑胶应该是很好的smear现象。
酶切gDNA一帮可用来做Southern blot.
200ng/
【在 c****9 的大作中提到】
: 我正在做一种固氮菌的酶切。chromosome材料应该没问题的，quantification是200ng/
: ul.所以我用了5ul的chromosome, 1ul EcoR1， 4ul Eco buffer， 30ul diH2O.再分开
: 入4个小试管里面，保存在37度的水浴里面分别5MIN, 30MIN, 1H, 2H,然后移入65度的
: 水浴30分钟，再跑胶，但是做了2次，发现DNA都没有被切开。然后换了HindIII和NEB
: Buffer2,结果也是没有切开。请教各位这个是哪个环节出问题了呢？是否有更好的办法
: 做酶切呢？谢谢。
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