G******n
发帖数: 289 | 1 少量肯定没问题，就像你们core说的，200ng就可以做了。200ng不用做太多的primer
specific amp，普通的20cycle AMP不影响结果。我是说你的两组或者多组sample都要
有同样的protocol |
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x*******a
发帖数: 11067 | 2 12周的B超唐筛结果很好，但15周(应该是16周,我去早了)的ＡＦＰ检查结果很不好，检
查结果是217ng/ml. Risk 1:14。
网上查了一些资料，这个值是高了。
孕期时间计算应该没问题，也不是双胞胎。就是因为有个大肌瘤在宝宝附近，一直有出血，不知道胎盘会不会有问题，而这个问题会不会影响结果。
下周去做Level II Sonogram，希望不要做羊穿。
怀孕期间一直不爱吃青菜，现在很后悔很后悔。
放一份最全的资料在这了。
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孕期准妈妈甲胎蛋白（AFP）不同孕周的参考值(正常值)
AFP是血清中一种α球蛋白，分子量68000，从妊娠6周开始由卵黄囊和胎儿肝产生
，13周达到高峰，胎儿出生后3个月至第二年逐渐降至成孕人水平并保持终身。主要起
免疫抑制作用。它不仅是胎儿宫内发育状态的重要监测指标，同时又是肿瘤组织产生的
肿瘤标志物之一，因此在围产保健和肿瘤诊治方面有重要作用，并已列常规检查。AFP
放免定量克服了普通的AFP定性的使用局限性和单一片面性，以确切的数值形式，表达
血液中AFP实际水平，客观反映机体变化状态，对病情的... 阅读全帖 |
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j*****5
发帖数: 24 | 3 i am trying to making a SHRNA lentivirus vector ( pRNAT from Gene script),
however, i was unable to get positive clone, And the yield of the plasmid
is also very low ( around 200ng/ul) I used HB101 E.coli competent cells,
Anybody can help me out? Thanks in advance. |
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r*********y
发帖数: 124 | 4 我做M2 FLAG IP后的蛋白在0.5mg/ml 3XFLAG 室温1小时可以很好的 洗下来（4ml 洗脱
体积)。在跑胶之前需要除去过量的3XFLAG,同时把体积浓缩到100-150ul。我先用GE
G25 gel filtration column除去3XFLAG, 然后用vivan spin 6浓缩，发现还有很多
3FLAG在样品里。
另外我的样品在浓缩之后很粘，上样的体积加大后胶就跑的很慢还smeared（我的bait
蛋白最多200ng)。所有纯化，浓缩都用同样的buffer, 20mMTris pH7.5, 150NaCL, 10%
Glycerol, 1%NP-40, 1mM DTT, 1mM EDTA.我想请教高手;
(1) 如何除去多余的3FLAG
(2)如何避免浓缩是样品过粘影响跑胶。
谢谢 |
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s********2
发帖数: 138 | 5 嗯,oldmonster 批评的是，我总觉得自己现在的表达水平骤降。我用的是BigDye
teminator cycle sequencing kit进行测序。试剂盒里面自带一个质粒和引物，作为
control，产物和引物比例是200ng：3.2pmol（因为是双链质粒，所以用量大）。我用
的是纯化后的PCR产物和自己的引物，并且产物纯化后的A260/A280也是1.7-2.0。产物
和引物的比例是50ng：3.2pmol。进行cycle 标记，进行了25个循环。然后将标记后的
产物用Ethanol/EDTA 进行纯化。结果是：control出来结果很好，而自己的产物却只有
在很前面的地方有很高的几个峰，根本不是产物。所以我怀疑我的产物根本没有标记上
？不知道这样是不是还是不够详细。希望大家能够帮帮我！ |
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s********2
发帖数: 138 | 6 这个就是我得到的两个结果。sample就是自己的样品，另外一个是control。希望大家
能够帮帮我！谢谢了。
质粒和引物，作为control，产物和引物比例是200ng：3.2pmol（因为是双链质粒，所
以用量大）。我用的是纯化后的PCR产物和自己的引物，并且产物纯化后的A260/A280也
是1.7-2.0。产物
产物纯化试剂盒，利用了专门用于测序的那种纯化试剂盒。第二，我尝试着用了DNA浓
度梯度。但是出来的结果都是一样的。只是在最前面有几个峰。我真是不知道到底是哪
里出问题了。希望大家能够帮我分析一下。 |
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k*******s
发帖数: 214 | 7 这是sequencing PCR reaction根本没有开始，有几个可能
1. 你的引物的Tm太低，在同样退火温度下，引物没有结合好。
2. 模板的溶度太低。
3. 模板样品里面有抑制PCR反应的物质，比如EDTA
另外BigDye很稳定，自带的对照肯定能做出来，因为样品最纯的，引物M13也是最常用
的，本身做这个对照没有意义。
质粒和引物，作为control，产物和引物比例是200ng：3.2pmol（因为是双链质粒，所
以用量大）。我用的是纯化后的PCR产物和自己的引物，并且产物纯化后的A260/A280也
是1.7-2.0。产物
产物纯化试剂盒，利用了专门用于测序的那种纯化试剂盒。第二，我尝试着用了DNA浓
度梯度。但是出来的结果都是一样的。只是在最前面有几个峰。我真是不知道到底是哪
里出问题了。希望大家能够帮我分析一下。注： 后面有结果图片。 |
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c****9
发帖数: 95 | 8 我正在做一种固氮菌的酶切。chromosome材料应该没问题的，quantification是200ng/
ul.所以我用了5ul的chromosome, 1ul EcoR1， 4ul Eco buffer， 30ul diH2O.再分开
入4个小试管里面，保存在37度的水浴里面分别5MIN, 30MIN, 1H, 2H,然后移入65度的
水浴30分钟，再跑胶，但是做了2次，发现DNA都没有被切开。然后换了HindIII和NEB
Buffer2,结果也是没有切开。请教各位这个是哪个环节出问题了呢？是否有更好的办法
做酶切呢？谢谢。 |
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s********s
发帖数: 67 | 9 一般来说chromosome DNA overnight切完应该是smear。
200ng/ |
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s******s
发帖数: 13035 | 10 什么叫做chromosome应该没有问题？phenol再抽一遍再切看看
200ng/ |
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k*******s
发帖数: 214 | 11 gDNA酶切有几个注意事项
1. gDNA一定要干净，质量好。酶切之前要跑胶看看。
2. 酶切体积要大些，1ug的要50uL体积更好
3. 酶要多加些，一般要总体积的5%
4. 酶切反应时间可以延长到overnight. 一般在反应几个小时后，可以再加几ul酶继
续切。
5. 最后跑胶应该是很好的smear现象。
酶切gDNA一帮可用来做Southern blot.
200ng/ |
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b*******6
发帖数: 39 | 12 具体步骤基本是这样的：
1 PCR 50-100 ul体系，所得产物跑胶后回收，所有产物均酶切（大概5ug，可能很多，
但是太少了最后会看不到；Fastdigest推荐protocol是切200ng 1ul酶，10min；所以开
始的时候切3个小时，因为当初质粒3个小时能切下来；后来过夜切，出现2个条带；PCR
产物比比质粒难切）；质粒一般切4ug，3个小时（BamH1切1小时，Hind31小时，碱性磷
酸酶1小时），或者在Bamh1灭活之后Hind3过夜切（BamH1据说明书超过1小时就有星号
活性）；酶切体系50ul，Fastdigest酶各1ul。所有酶切产物切胶回收，nanodrop定量。
2 连接50ng质粒，50ng片段（大小比是5：1，所以数量比大概是1：5），10ul体系，室
温1小时或者4度过夜。
3 转化：5ul产物加入到50-100ul感受态，冰浴30min，42度热激90s，冰浴2min，加入
800ul LB，37度30-45min，3500rpm 3min 离心，留100-200ul混匀细菌涂板。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 13 What's the concentration of the plasmid?
I assume 25ng/ul is quite low for miniprep plasmid. And you just juse 50ng
DNA and 80ul bacteria (that's a lot for transformation). You know, heat
shock transformation efficiency is low and by doing so you make the
efficiency much lower...
I suggest you to try high concentration, let's say, 200ng/ul, and then mix
with 40ul competent cells, 30min on ice, 42 for 45s, 2min on ice and then
plate all. Let's see if there is any colony after the second try.
Howe... 阅读全帖 |
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N2
发帖数: 81 | 14 It should work. This kind of method is very efficient. Here are some points
maybe be useful.
1) Gel purify you PCR product.
2)use Nanodrop to estimate the concentration of your PCR products
3) add all fragment 1:1 ratio to vector. Add 100-200ng vector part. It also
depends your fragment size. you may add up to 500ug total DNA per reaction I
guess.
4) you can put 20-40nt overlap between joint points.
How do you screen you positive colonies? Use cloning PCR to check the joints
? you can just scree... 阅读全帖 |
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z*********8
发帖数: 1203 | 15 我别的都跟你说的那样做的，只有pcr我跑胶看到都是单条带，所以就只有 column
purification。你觉得是我没有割胶纯化的问题么？？
发信人: N2 (Huahua), 信区: Biology
标 题: Re: 怎样用infusion kit克隆多个PCR 片段？？
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jul 26 17:52:12 2011, 美东)
It should work. This kind of method is very efficient. Here are some points
maybe be useful.
1) Gel purify you PCR product.
2)use Nanodrop to estimate the concentration of your PCR products
3) add all fragment 1:1 ratio to vector. Add 100-200ng vector part. It also
depends your fragment size. you may add up to 5... 阅读全帖 |
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f****h
发帖数: 41 | 16 I have a question to ask people who know molecular biology. I have a plasmid
in DH5a cells and I can get 10ug DNA (200ng/uL, 50uL) from 1.5mL miniprep
culture. However, when I cultured 250mL for maxiprep, I only got 130ug DNA,
which is more than 10 times less than what I expected. The procedure of
extracting DNA should be fine because I got 900ug DNA from another plasmid
in parallel.
Can anyone give me some comments/suggestions? Thank you so much! |
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D**R
发帖数: 371 | 17 最近做了一批RNA Extraciton，用NanoDrop测时碰到一个问题，大部分的RNA value都
在范围之内5-25 ng/ul，可是有两三个的samples值很高，超过200ng/ul，但是qPCR却
一点amplification也没有，那那个OD260 peak到底是什么东西呢？我们的是人的
sample，那些有bacterial contamination？怎么可以把它们去掉呢？多谢多谢 |
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s****s
发帖数: 16 | 18 实验碰到难题了。最近从原代细胞里提取了genomic DNA，在agarose（ETBR）胶上可以
看到很清楚的band。然后用新购买的Qiagen的Epitech Bilsulte kit作bisulite
treatment。gDNA的input量是2 ug。 一切按照protocol做和DNA clean和column收集。
260／280 ratio 是2左右。但是到最后跑胶（200ng），什么都没有见到。做了几次，
都是这样。犹豫是否继续下一步的PCR。请有经验的大侠帮trouble shooting一下。不
胜感激。 |
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p********l
发帖数: 233 | 19 Our lab is working on RNA-seq with small RNA input. Honestly, if you use
available commercial kit, you should be fine with 100-200ng RNA. The core
usually request more just for backup. |
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s********8
发帖数: 619 | 20 谢谢楼上各位的回复！我们的sequencing facility好像没有amplification的经验，他
们说要200ng RNA。我再去问问吧。
我也不太想扩增，尽量多做几次FACS，冻起来一起提吧。 |
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发帖数: 1 | 21 我一直用Clontech In-fusion，曾经一次将三个GFP tandem链接到一个10kb载体，一次
成功。In-fusion效率几乎100%，以至于我现在克隆所有片段都是用Phusion PCR出来，
In-fusion后挑一个菌落抽质粒直接测序。
用Infusion的时候最重要的两点是overlapping区域一定要是15bp，另外就是insertion
和vector的比例。如果你是克隆到8kb载体中，其他3kb,1kb,2kb与8kb的molar ratio应
该为1：1：1：0.5。你可以用clontech的infusion MOLAR ratio calculator。可惜的
是clontech被TaKaRa买了，网站变得奇差。你可以自己算。8kb vector以为200ng为准
，那么3kb是150ng，1kb是50ng，2kb是100ng。建议所有片段PCR，然后跑胶纯化，
nanodrop测浓度。如果浓度不高，那么可以整体scale down，但是ratio一定要是1：1
：1：0.5。
等有了8kb这个克隆，你就可以直接PCR中间3kb-1kb-2kb，然后... 阅读全帖 |
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h******d
发帖数: 4761 | 22 那估计你是PRL〉200ng/dL级别的。
建议检查脑垂体！ |
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