n***w
发帖数: 2405 | 1 最近做了几次，然后用Western去检测蛋白表达，目的条带在supernatant，不在pellet
中，尽管除了很浅的目的条带外，还有其他蛋白条带（信号很强）。但是如果用HA－
tag抗体去probe，却detect不出目的条带（有些非特异性的带）。是HA-domain被mask
了？还是说我的蛋白压根就没有表达。。。。
我又回去查了一下序列，没有错。。。。
大家帮我一起troubleshoot说说。。谢谢！ |
P******n
发帖数: 20 | 2 Compare uninduced and induced cells, and you should know if the protein is
overexpressed. |
m**z
发帖数: 787 | 3 re this. And I don't think you would really need western blot to see protein
expression if the protein is overexpressed.
【在 P******n 的大作中提到】
: Compare uninduced and induced cells, and you should know if the protein is
: overexpressed.
|
n***w
发帖数: 2405 | 4 Thank you. I did this just on SDS-PAGE but no difference. I cannot see a
difference... =(
protein
【在 m**z 的大作中提到】
: re this. And I don't think you would really need western blot to see protein
: expression if the protein is overexpressed.
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T**********t
发帖数: 1604 | 5 You can try using different media/temp/IPTG concentration to optimize the
expression. I recently heard about this kit:
http://www.athenaes.com/PERK.php
I haven't tried it myself, though. But for $150, I think it's worth trying. |
e****s
发帖数: 1125 | 6 Western能测出来那应该就是有表达了，特别如果也是这个HA抗体的话，那就是HA-tag
在正常折叠的蛋白中被覆盖了，或者抗体浓度不是很合适？
如果对WB结果不是很有信心的话，换一个HA抗体看看。
另外IPTG条件优化一下肯定有帮助，你的表达肯定很低。有一个方法也可以帮你确定是
否真是你的目标蛋白，随着IPTG的增加，通常在Total lysis里的蛋白量是增加的(Sup
里当然不一定)。如果你能看到在一定IPTG浓度范围内，该条带增加，就表示是你的目
标蛋白了。
Expression test一般用个5ml就可以了，省事些。
pellet
mask
【在 n***w 的大作中提到】
: 最近做了几次，然后用Western去检测蛋白表达，目的条带在supernatant，不在pellet
: 中，尽管除了很浅的目的条带外，还有其他蛋白条带（信号很强）。但是如果用HA－
: tag抗体去probe，却detect不出目的条带（有些非特异性的带）。是HA-domain被mask
: 了？还是说我的蛋白压根就没有表达。。。。
: 我又回去查了一下序列，没有错。。。。
: 大家帮我一起troubleshoot说说。。谢谢！
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n***w
发帖数: 2405 | 7 非常感谢。
我明天试试！
tag
Sup
【在 e****s 的大作中提到】
: Western能测出来那应该就是有表达了，特别如果也是这个HA抗体的话，那就是HA-tag
: 在正常折叠的蛋白中被覆盖了，或者抗体浓度不是很合适？
: 如果对WB结果不是很有信心的话，换一个HA抗体看看。
: 另外IPTG条件优化一下肯定有帮助，你的表达肯定很低。有一个方法也可以帮你确定是
: 否真是你的目标蛋白，随着IPTG的增加，通常在Total lysis里的蛋白量是增加的(Sup
: 里当然不一定)。如果你能看到在一定IPTG浓度范围内，该条带增加，就表示是你的目
: 标蛋白了。
: Expression test一般用个5ml就可以了，省事些。
:
: pellet
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n***w
发帖数: 2405 | 8 我觉得我可能找到原因了。
我觉得是载体的原因。我会换载体。 |
