n***w 发帖数: 2405 | 1 最近做了几次,然后用Western去检测蛋白表达,目的条带在supernatant,不在pellet
中,尽管除了很浅的目的条带外,还有其他蛋白条带(信号很强)。但是如果用HA-
tag抗体去probe,却detect不出目的条带(有些非特异性的带)。是HA-domain被mask
了?还是说我的蛋白压根就没有表达。。。。
我又回去查了一下序列,没有错。。。。
大家帮我一起troubleshoot说说。。谢谢! |
P******n 发帖数: 20 | 2 Compare uninduced and induced cells, and you should know if the protein is
overexpressed. |
m**z 发帖数: 787 | 3 re this. And I don't think you would really need western blot to see protein
expression if the protein is overexpressed.
【在 P******n 的大作中提到】 : Compare uninduced and induced cells, and you should know if the protein is : overexpressed.
|
n***w 发帖数: 2405 | 4 Thank you. I did this just on SDS-PAGE but no difference. I cannot see a
difference... =(
protein
【在 m**z 的大作中提到】 : re this. And I don't think you would really need western blot to see protein : expression if the protein is overexpressed.
|
T**********t 发帖数: 1604 | 5 You can try using different media/temp/IPTG concentration to optimize the
expression. I recently heard about this kit:
http://www.athenaes.com/PERK.php
I haven't tried it myself, though. But for $150, I think it's worth trying. |
e****s 发帖数: 1125 | 6 Western能测出来那应该就是有表达了,特别如果也是这个HA抗体的话,那就是HA-tag
在正常折叠的蛋白中被覆盖了,或者抗体浓度不是很合适?
如果对WB结果不是很有信心的话,换一个HA抗体看看。
另外IPTG条件优化一下肯定有帮助,你的表达肯定很低。有一个方法也可以帮你确定是
否真是你的目标蛋白,随着IPTG的增加,通常在Total lysis里的蛋白量是增加的(Sup
里当然不一定)。如果你能看到在一定IPTG浓度范围内,该条带增加,就表示是你的目
标蛋白了。
Expression test一般用个5ml就可以了,省事些。
pellet
mask
【在 n***w 的大作中提到】 : 最近做了几次,然后用Western去检测蛋白表达,目的条带在supernatant,不在pellet : 中,尽管除了很浅的目的条带外,还有其他蛋白条带(信号很强)。但是如果用HA- : tag抗体去probe,却detect不出目的条带(有些非特异性的带)。是HA-domain被mask : 了?还是说我的蛋白压根就没有表达。。。。 : 我又回去查了一下序列,没有错。。。。 : 大家帮我一起troubleshoot说说。。谢谢!
|
n***w 发帖数: 2405 | 7 非常感谢。
我明天试试!
tag
Sup
【在 e****s 的大作中提到】 : Western能测出来那应该就是有表达了,特别如果也是这个HA抗体的话,那就是HA-tag : 在正常折叠的蛋白中被覆盖了,或者抗体浓度不是很合适? : 如果对WB结果不是很有信心的话,换一个HA抗体看看。 : 另外IPTG条件优化一下肯定有帮助,你的表达肯定很低。有一个方法也可以帮你确定是 : 否真是你的目标蛋白,随着IPTG的增加,通常在Total lysis里的蛋白量是增加的(Sup : 里当然不一定)。如果你能看到在一定IPTG浓度范围内,该条带增加,就表示是你的目 : 标蛋白了。 : Expression test一般用个5ml就可以了,省事些。 : : pellet
|
n***w 发帖数: 2405 | 8 我觉得我可能找到原因了。
我觉得是载体的原因。我会换载体。 |