b**y
发帖数: 86 | 1 最近刚开始做EMSA，我用的是Pierce的Lightshift kit. 多次实验都只看到
nonspecifec binding（不能被unlabeled oligo竞争掉）。我发现一个原因可能是
binding reaction里盐浓度过高，因为kit提供的binding buffer（10*）含有500mM
KCl,而我的nuclear extract最后是由high salt buffer提取的，F.C.225mM NaCl。于
是我省略了binding buffer，把最后的NaCl浓度调整在50-75mM，得到了一条specific
的binding，但是非常弱。
问题1. 我看到的paper和protocol都使有类似的binding buffer，而且也用类似方法提
取核蛋白，好像并不考虑nuclear extract里的盐浓度，事实上这个浓度很高。但是，
我的几个sample extract蛋白浓度不同，加入同样多的蛋白的话最终盐浓度就会不同。
大家怎么解决这个问题？透析又怕蛋白容易降解。
问题2. 我加入的nuclear extract的体积无法忽略，大概有10ul，因为我的蛋白浓度一
直很低。--我用high salt方法提核蛋白浓度一直很低，虽然已经使用了20M细胞，最终
获得<200ug蛋白。正常吗?
问题3. 我的specific band还是很弱，不知道应该如何调节binding的条件？我现在的
binding condition是：75mM Nacl， 10mMHEPES， 8%Glycerol， 1mM EDTA， 4mM
MgCl2， 2mM DTT。6% native PAGE， running buffer是 0.5* TBE。我的目标蛋白大
概是140kD， probe 23bp.
谢谢指教！ |
B****N
发帖数: 18 | 2 透析一下试试。我的蛋白量也很少，EMSA根本不行。后来透析了就work了。 |
w******e
发帖数: 1187 | 3 try millipore YM columns for buffer exchange+concentration?
specific
【在 b**y 的大作中提到】
: 最近刚开始做EMSA，我用的是Pierce的Lightshift kit. 多次实验都只看到
: nonspecifec binding（不能被unlabeled oligo竞争掉）。我发现一个原因可能是
: binding reaction里盐浓度过高，因为kit提供的binding buffer（10*）含有500mM
: KCl,而我的nuclear extract最后是由high salt buffer提取的，F.C.225mM NaCl。于
: 是我省略了binding buffer，把最后的NaCl浓度调整在50-75mM，得到了一条specific
: 的binding，但是非常弱。
: 问题1. 我看到的paper和protocol都使有类似的binding buffer，而且也用类似方法提
: 取核蛋白，好像并不考虑nuclear extract里的盐浓度，事实上这个浓度很高。但是，
: 我的几个sample extract蛋白浓度不同，加入同样多的蛋白的话最终盐浓度就会不同。
: 大家怎么解决这个问题？透析又怕蛋白容易降解。
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b**y
发帖数: 86 | 4 Thanks! Which product did you use?
【在 B****N 的大作中提到】
: 透析一下试试。我的蛋白量也很少，EMSA根本不行。后来透析了就work了。
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B****N
发帖数: 18 | |
