s******r
发帖数: 2876 | 1 同样的sample，同样的actin抗体，follow它的protocol，
ECL 1 min 有很清楚的带，Odyssey扫出来的看不见，加强intensity也只有很淡的条带，
大家有什么经验，Odyssey能达到普通ECL的灵敏度吗？ |
I*****y
发帖数: 6402 | 2 ECL用的二抗有HRP酶，而Odyssey用的二抗是有荧光的。这个灵敏度应该是有差异的，
不过我不确定Odyssey的灵敏度是否差一些
带，
【在 s******r 的大作中提到】
: 同样的sample，同样的actin抗体，follow它的protocol，
: ECL 1 min 有很清楚的带，Odyssey扫出来的看不见，加强intensity也只有很淡的条带，
: 大家有什么经验，Odyssey能达到普通ECL的灵敏度吗？
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f*********r
发帖数: 1233 | 3 为了能一次就找出问题，请提供以下信息：
1）二抗的厂家和cat. #
2）odyssey扫描参数
3）扫描所得图像，一共三个图（波长700黑白，波长800黑白，两个波长混合彩色） |
s******y
发帖数: 28562 | 4 正常。
其实就是因为显示的方式问题，把对比调一下就好了
带，
【在 s******r 的大作中提到】
: 同样的sample，同样的actin抗体，follow它的protocol，
: ECL 1 min 有很清楚的带，Odyssey扫出来的看不见，加强intensity也只有很淡的条带，
: 大家有什么经验，Odyssey能达到普通ECL的灵敏度吗？
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s******r
发帖数: 2876 | 5 多谢你能抽空指点，
我block用的是5% milk in 1xTBST,
2抗之前步骤都相同，同一张膜剪两半。
2抗也是5% milk,1xTBST, 室温1hr，
TBST洗完了后，PBS洗两边，膜完全晾干后scan.
1), 2Ab是Licor自己的IRDye 800CW Goat anti-Mouse，#926-32210
1:5000 in 5% milk.
2), 双色彩图700 intensity 2.5, 800 intensity 5.
800单独扫描参数是 intensity 7.5.
sensitivity都用的缺省值5。
3), 上了四个图，ECL扫描的图，彩图包括700和800 channel，参数如上，
800单色图，参数如上，800灰度图，从800单色图export，没有压缩。
主要比较第一条lane。
因为只用了一种一抗，所以700灰度图应该没什么用。
麻烦帮着诊断诊断。
【在 f*********r 的大作中提到】
: 为了能一次就找出问题，请提供以下信息：
: 1）二抗的厂家和cat. #
: 2）odyssey扫描参数
: 3）扫描所得图像，一共三个图（波长700黑白，波长800黑白，两个波长混合彩色）
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s******r
发帖数: 2876 | 6 你觉得ECL和Odyssey比哪个更灵敏一些？
我知道这里可能有带，所以还能调来调去看能不能出来，
如果是不知道的话，可能就会当做没有带了。
正常。
其实就是因为显示的方式问题，把对比调一下就好了
带，
【在 s******y 的大作中提到】
: 正常。
: 其实就是因为显示的方式问题，把对比调一下就好了
:
: 带，
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s**********o
发帖数: 14 | 7 我一直用Licor，我的经验是他的灵敏度要比ecl高。
我增经用过低于5ug的total protein上样，actin的结果也还是非常好。
要trouble shooting别人的问题，总是比较难。根据你的介绍，
我不知道blocking buffer是不是问题，在licor的manual里，
他有专门的blocking buffer的配方的，我一直用那个，配完后分装冻起来。
用milk和BSA据说都会减弱或者产生比较强的background。我们旁边的实验室
也有人用milk,但他们2抗用的浓度要大，1；2000。我一般用1：10000。
还有一个问题就是，不知道你的2抗是不是长期放在4度，时间太长会显著的降低他的灵
敏度的。
分装，放在4度尽量在1-2月内用完，最好。
别的，我也不知道了，你先试试，回头UPDATE一下进展。 |
s**********o
发帖数: 14 | |
f*********r
发帖数: 1233 | 9 actin，我的理解是表达极强的蛋白。基本可以看作是housekeeping，做loading
control。所以应该是极强，至少也是很强。在默认设置下，应该是强信号，甚至是过
饱和。这种背景还算低，但actin信号几乎没有的情况，说明western本身有问题。
如果其他步骤没有出差错的话，最大问题就是二抗-milk组合出了问题。
odyssey是不推荐使用奶粉的。就是因为它太灵敏，牛奶甚至普通bsa的背景太高。
因为很多公司这么做，所以我怀疑licor也可能会这样。licor一向推荐自己出的二抗和
blocking buffer。尤其是后者，比牛奶和bsa都贵很多，是他们公司主打消耗品之一。
他们非常不愿意见到客户用廉价的奶粉。别家出的二抗他管不了，但是自家的二抗，很
可能有什么技术，保证它与奶粉和普通bsa不兼容。
下面有两个选项可以尝试一下。
1）改用licor专用blocking buffer试一下。
2）改用别家二抗试一下。（rockland, invitrogen等公司都有比较成熟的红外荧光二
抗）。
2个选项交叉试一下，一共4种条件（含原先二抗-奶粉组合）。有了这四种对比，就可
以明确到底是二抗问题，还是奶粉问题，还是两者都有问题。 |
f*********r
发帖数: 1233 | 10 我也觉得不用晾干。当然，晾干也可以。
湿的条件，尤其是在扫描平面上加上一些水，然后放上膜，就有了类似全反射的效果，
就像显微镜油镜。在信号比较弱的情况下，湿比干效果好。
【在 s**********o 的大作中提到】
: 还有一个，你的膜为何要晾干？？
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s******y
发帖数: 28562 | 11 你的那种绿色的膜背景很高啊，不知道你用的是不是Nitrocellulose?
如果你不小心用错了PVDF，会导致背景非常高！
另外，最好不要用牛奶。我的经验是，要么就用牛奶里面提纯的那个casein，
那么就乖乖的用Licor 产的blocking buffer。直接用牛奶的话也很容易导致
背景很高。
在我的经验里，Licor Odessey 的灵敏度比Femto kit稍微低一点点，但是
绝对比普通的ECL强的多
【在 s******r 的大作中提到】
: 多谢你能抽空指点，
: 我block用的是5% milk in 1xTBST,
: 2抗之前步骤都相同，同一张膜剪两半。
: 2抗也是5% milk,1xTBST, 室温1hr，
: TBST洗完了后，PBS洗两边，膜完全晾干后scan.
: 1), 2Ab是Licor自己的IRDye 800CW Goat anti-Mouse，#926-32210
: 1:5000 in 5% milk.
: 2), 双色彩图700 intensity 2.5, 800 intensity 5.
: 800单独扫描参数是 intensity 7.5.
: sensitivity都用的缺省值5。
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s**********o
发帖数: 14 | 12 其实从sigma买东西自己配的话，也很便宜
【在 f*********r 的大作中提到】
: actin，我的理解是表达极强的蛋白。基本可以看作是housekeeping，做loading
: control。所以应该是极强，至少也是很强。在默认设置下，应该是强信号，甚至是过
: 饱和。这种背景还算低，但actin信号几乎没有的情况，说明western本身有问题。
: 如果其他步骤没有出差错的话，最大问题就是二抗-milk组合出了问题。
: odyssey是不推荐使用奶粉的。就是因为它太灵敏，牛奶甚至普通bsa的背景太高。
: 因为很多公司这么做，所以我怀疑licor也可能会这样。licor一向推荐自己出的二抗和
: blocking buffer。尤其是后者，比牛奶和bsa都贵很多，是他们公司主打消耗品之一。
: 他们非常不愿意见到客户用廉价的奶粉。别家出的二抗他管不了，但是自家的二抗，很
: 可能有什么技术，保证它与奶粉和普通bsa不兼容。
: 下面有两个选项可以尝试一下。
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s**********o
发帖数: 14 | 13 PVDF还好吧，我就是用这个
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的那种绿色的膜背景很高啊，不知道你用的是不是Nitrocellulose?
: 如果你不小心用错了PVDF，会导致背景非常高！
: 另外，最好不要用牛奶。我的经验是，要么就用牛奶里面提纯的那个casein，
: 那么就乖乖的用Licor 产的blocking buffer。直接用牛奶的话也很容易导致
: 背景很高。
: 在我的经验里，Licor Odessey 的灵敏度比Femto kit稍微低一点点，但是
: 绝对比普通的ECL强的多
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s******r
发帖数: 2876 | 14 谢谢，有空我再试一下，二抗跟别人借的，也可能有点问题。
我一直用Licor，我的经验是他的灵敏度要比ecl高。
我增经用过低于5ug的total protein上样，actin的结果也还是非常好。
要trouble shooting别人的问题，总是比较难。根据你的介绍，
我不知道blocking buffer是不是问题，在licor的manual里，
他有专门的blocking buffer的配方的，我一直用那个，配完后分装冻起来。
用milk和BSA据说都会减弱或者产生比较强的background。我们旁边的实验室
也有人用milk,但他们2抗用的浓度要大，1；2000。我一般用1：10000。
还有一个问题就是，不知道你的2抗是不是长期放在4度，时间太长会显著的降低他的灵
敏度的。
分装，放在4度尽量在1-2月内用完，最好。
别的，我也不知道了，你先试试，回头UPDATE一下进展。
【在 s**********o 的大作中提到】
: 我一直用Licor，我的经验是他的灵敏度要比ecl高。
: 我增经用过低于5ug的total protein上样，actin的结果也还是非常好。
: 要trouble shooting别人的问题，总是比较难。根据你的介绍，
: 我不知道blocking buffer是不是问题，在licor的manual里，
: 他有专门的blocking buffer的配方的，我一直用那个，配完后分装冻起来。
: 用milk和BSA据说都会减弱或者产生比较强的background。我们旁边的实验室
: 也有人用milk,但他们2抗用的浓度要大，1；2000。我一般用1：10000。
: 还有一个问题就是，不知道你的2抗是不是长期放在4度，时间太长会显著的降低他的灵
: 敏度的。
: 分装，放在4度尽量在1-2月内用完，最好。
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s******y
发帖数: 28562 | 15 PVDF在我的经验中只能湿的时候用，一旦晒干就会有很强的背景荧光
【在 s**********o 的大作中提到】
: PVDF还好吧，我就是用这个
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s******r
发帖数: 2876 | 16 这个sample本身就比较稀，第一条lane已经是1:5稀释，后面是1:25, 1:125稀释。
所以western 本身的问题应该不大，主要是想看看在我手里ECL和Odyssey哪个好使，
可能二抗和blocking buffer都不够好，所以我这个看起来Odyssey比普通ECL要弱上
几倍。
actin，我的理解是表达极强的蛋白。基本可以看作是housekeeping，做loading
control。所以应该是极强，至少也是很强。在默认设置下，应该是强信号，甚至是过
饱和。这种背景还算低，但actin信号几乎没有的情况，说明western本身有问题。
如果其他步骤没有出差错的话，最大问题就是二抗-milk组合出了问题。
odyssey是不推荐使用奶粉的。就是因为它太灵敏，牛奶甚至普通bsa的背景太高。
因为很多公司这么做，所以我怀疑licor也可能会这样。licor一向推荐自己出的二抗和
blocking buffer。尤其是后者，比牛奶和bsa都贵很多，是他们公司主打消耗品之一。
他们非常不愿意见到客户用廉价的奶粉。别家出的二抗他管不了，但是自家的二抗，很
可能有什么技术，保证它与奶粉和普通bsa不兼容。
下面有两个选项可以尝试一下。
1）改用licor专用blocking buffer试一下。
2）改用别家二抗试一下。（rockland, invitrogen等公司都有比较成熟的红外荧光二
抗）。
2个选项交叉试一下，一共4种条件（含原先二抗-奶粉组合）。有了这四种对比，就可
以明确到底是二抗问题，还是奶粉问题，还是两者都有问题。
【在 f*********r 的大作中提到】
: actin，我的理解是表达极强的蛋白。基本可以看作是housekeeping，做loading
: control。所以应该是极强，至少也是很强。在默认设置下，应该是强信号，甚至是过
: 饱和。这种背景还算低，但actin信号几乎没有的情况，说明western本身有问题。
: 如果其他步骤没有出差错的话，最大问题就是二抗-milk组合出了问题。
: odyssey是不推荐使用奶粉的。就是因为它太灵敏，牛奶甚至普通bsa的背景太高。
: 因为很多公司这么做，所以我怀疑licor也可能会这样。licor一向推荐自己出的二抗和
: blocking buffer。尤其是后者，比牛奶和bsa都贵很多，是他们公司主打消耗品之一。
: 他们非常不愿意见到客户用廉价的奶粉。别家出的二抗他管不了，但是自家的二抗，很
: 可能有什么技术，保证它与奶粉和普通bsa不兼容。
: 下面有两个选项可以尝试一下。
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s******r
发帖数: 2876 | 17 是PVDF，millipore non-fluoscence的，用intensity 7.5，背景已经很高了，
anyway，想省钱大概是不行了。
你的那种绿色的膜背景很高啊，不知道你用的是不是Nitrocellulose?
如果你不小心用错了PVDF，会导致背景非常高！
另外，最好不要用牛奶。我的经验是，要么就用牛奶里面提纯的那个casein，
那么就乖乖的用Licor 产的blocking buffer。直接用牛奶的话也很容易导致
背景很高。
在我的经验里，Licor Odessey 的灵敏度比Femto kit稍微低一点点，但是
绝对比普通的ECL强的多
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的那种绿色的膜背景很高啊，不知道你用的是不是Nitrocellulose?
: 如果你不小心用错了PVDF，会导致背景非常高！
: 另外，最好不要用牛奶。我的经验是，要么就用牛奶里面提纯的那个casein，
: 那么就乖乖的用Licor 产的blocking buffer。直接用牛奶的话也很容易导致
: 背景很高。
: 在我的经验里，Licor Odessey 的灵敏度比Femto kit稍微低一点点，但是
: 绝对比普通的ECL强的多
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f*********r
发帖数: 1233 | 18 你的结论有两点不确切。
第一，背景并非很强。我以前专门发贴阐述过这个问题。你的那张膜是个很典型的例子。
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31358315.html
请注意该贴第二页的跟贴。有些具体的图例讲解图像调节问题。
第二，费用方面。硬件上，建造暗室、购买和安装设备的费用不比licor节省。耗材上
，底片、显影药都不便宜，而且还有回收废液的费用。
【在 s******r 的大作中提到】
: 是PVDF，millipore non-fluoscence的，用intensity 7.5，背景已经很高了，
: anyway，想省钱大概是不行了。
:
: 你的那种绿色的膜背景很高啊，不知道你用的是不是Nitrocellulose?
: 如果你不小心用错了PVDF，会导致背景非常高！
: 另外，最好不要用牛奶。我的经验是，要么就用牛奶里面提纯的那个casein，
: 那么就乖乖的用Licor 产的blocking buffer。直接用牛奶的话也很容易导致
: 背景很高。
: 在我的经验里，Licor Odessey 的灵敏度比Femto kit稍微低一点点，但是
: 绝对比普通的ECL强的多
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m*****l
发帖数: 28 | 19 看你probe什么蛋白了。 有的抗体在Licor上work的不如ECL， 有可能是二抗的问题。 |
m******5
发帖数: 1383 | 20 同发现PVDF绿色背景很高，得用红色
怎么解决？我有一个蛋白用Nitrocellulose做不出来
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的那种绿色的膜背景很高啊，不知道你用的是不是Nitrocellulose?
: 如果你不小心用错了PVDF，会导致背景非常高！
: 另外，最好不要用牛奶。我的经验是，要么就用牛奶里面提纯的那个casein，
: 那么就乖乖的用Licor 产的blocking buffer。直接用牛奶的话也很容易导致
: 背景很高。
: 在我的经验里，Licor Odessey 的灵敏度比Femto kit稍微低一点点，但是
: 绝对比普通的ECL强的多
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I*****y
发帖数: 6402 | 21 多大的蛋白？
【在 m******5 的大作中提到】
: 同发现PVDF绿色背景很高，得用红色
: 怎么解决？我有一个蛋白用Nitrocellulose做不出来
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m******5
发帖数: 1383 | 22 我用pvdf膜全膜绿色背景很高啊，和蛋白大小关系不大
【在 I*****y 的大作中提到】
: 多大的蛋白？
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I*****y
发帖数: 6402 | 23 pvdf的背景对于li-cor的荧光尔康就是背景高
【在 m******5 的大作中提到】
: 我用pvdf膜全膜绿色背景很高啊，和蛋白大小关系不大
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d****i
发帖数: 2346 | 24 Licor相对方便，但是太敏感，背景太高。如果你要strip就更麻烦，远不如ECL的strip
后好用。 |
r*****m
发帖数: 231 | 25 我个人的经验是LICOR的灵敏度介于ECL pico和femto之间，很弱的signal用LICOR看很
吃力，因为背景还是太高了，不像ECL，只要操作得好背景应该为0。
不过我觉得LICOR最要命的是二抗的specificity问题，IP下来的sample用不同species
的二抗竟然能看到很强的IgG，这个让我直接怀疑用它同时做两个primary的
specificity可靠性。。。事实上我也确实遇到过一个channel的signal透到另一个
channel的情况，不过不知道是荧光的bleed through还是二抗的cross－reactivity？ |
d*******e
发帖数: 110 | 26 我一直在用Licor Odessey，觉得Licor Odessey 的灵敏度非常的高。用的是它家的二
抗，稀释到1:10000都能得到很好的信号。我一直用5%的脱脂奶粉block， 有时候背景
比较强，但总体上好过得去。哪位好人能提供一下Licor Odessey自家的blocking
buffer 的配方，老板不同意买这个blocking buffer.
带，
【在 s******r 的大作中提到】
: 同样的sample，同样的actin抗体，follow它的protocol，
: ECL 1 min 有很清楚的带，Odyssey扫出来的看不见，加强intensity也只有很淡的条带，
: 大家有什么经验，Odyssey能达到普通ECL的灵敏度吗？
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y****6
发帖数: 196 | 27 Any one reuse Odyssey blocking buffer? How is the performance? |
g*********5
发帖数: 2533 | 28 用了4年licor了。感觉比ecl灵敏。
如果用pdvf （我一般只用nc），二抗中加点sds可以降低背景 。
actin不出来，原因应该是二抗问题。
还有，我从来不干膜，总是湿扫。
他家有专门的strip buffer，管用。
1:5，但是我用1：10，室温20分钟，4度两小时。
tbst洗4遍，可以直接用别的一抗。
有时候tubulin去不干净。
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的那种绿色的膜背景很高啊，不知道你用的是不是Nitrocellulose?
: 如果你不小心用错了PVDF，会导致背景非常高！
: 另外，最好不要用牛奶。我的经验是，要么就用牛奶里面提纯的那个casein，
: 那么就乖乖的用Licor 产的blocking buffer。直接用牛奶的话也很容易导致
: 背景很高。
: 在我的经验里，Licor Odessey 的灵敏度比Femto kit稍微低一点点，但是
: 绝对比普通的ECL强的多
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