p**i
发帖数: 3525 | 1 1. stacking gel 应该多长，由那些因素决定?
2. 除了蛋白的量过大外，有什么其他因素会导致类似于overload的现象?
谢谢 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 stacking gel 一般不应该超过1厘米。什么因素决定我不知道
除了量大，样品里的盐分过多或者含有一些改变水结构的有机溶剂（比方说DMSO,
guanadine) 也会让样品带涣散，和上样过多的结果类似
【在 p**i 的大作中提到】
: 1. stacking gel 应该多长，由那些因素决定?
: 2. 除了蛋白的量过大外，有什么其他因素会导致类似于overload的现象?
: 谢谢
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p**i
发帖数: 3525 | 3 谢谢，stacking gel 过长有什么不良后果?
【在 s******y 的大作中提到】
: stacking gel 一般不应该超过1厘米。什么因素决定我不知道
: 除了量大，样品里的盐分过多或者含有一些改变水结构的有机溶剂（比方说DMSO,
: guanadine) 也会让样品带涣散，和上样过多的结果类似
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s******y
发帖数: 28562 | 4 好像没有什么特别大的后果，除了会占据本来应该属于seperation gel的空间。
【在 p**i 的大作中提到】
: 谢谢，stacking gel 过长有什么不良后果?
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p**i
发帖数: 3525 | 5 哦，明白了。那我就搞得长一点。
上次跑样到stacking gel and seperating gel 边界线时有两个Well的样品还没出Well
，歪歪扭扭的, 结果gel的分辨率特低。这种情况Stacking gel 应该长点吧?
【在 s******y 的大作中提到】
: 好像没有什么特别大的后果，除了会占据本来应该属于seperation gel的空间。
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T**********t
发帖数: 1604 | 6 stacking gel 1厘米就够了，再短的话，浓缩效果不好，再长的话，给分离胶留的空间
太少。你那两个well的样品没跑出well，很有可能是你的stacking gel浓度还是太高了
吧，或者那两个样品的盐浓度或者pH不对。
Well
【在 p**i 的大作中提到】
: 哦，明白了。那我就搞得长一点。
: 上次跑样到stacking gel and seperating gel 边界线时有两个Well的样品还没出Well
: ，歪歪扭扭的, 结果gel的分辨率特低。这种情况Stacking gel 应该长点吧?
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s******y
发帖数: 28562 | 7 对。估计是楼主的样品里的盐浓度不对。
ｐＨ也可能不对，但是这个应该比较容易看出来，因为如果样品太酸的话上样液的色素
就会变绿色甚至黄色，很容易就注意到了。
【在 T**********t 的大作中提到】
: stacking gel 1厘米就够了，再短的话，浓缩效果不好，再长的话，给分离胶留的空间
: 太少。你那两个well的样品没跑出well，很有可能是你的stacking gel浓度还是太高了
: 吧，或者那两个样品的盐浓度或者pH不对。
:
: Well
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p**i
发帖数: 3525 | 8 谢谢T兄，stacking gel浓度还是只有4%。那可能是样品的问题，protein standard 就
跑得挺快的。
那应该咋样调样品的pH和盐浓度呢? 总共就那么一点小体积
【在 T**********t 的大作中提到】
: stacking gel 1厘米就够了，再短的话，浓缩效果不好，再长的话，给分离胶留的空间
: 太少。你那两个well的样品没跑出well，很有可能是你的stacking gel浓度还是太高了
: 吧，或者那两个样品的盐浓度或者pH不对。
:
: Well
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p**i
发帖数: 3525 | 9 好象颜色是有点类似绿黄色，那这种情况你是如何调的呢?
【在 s******y 的大作中提到】
: 对。估计是楼主的样品里的盐浓度不对。
: ｐＨ也可能不对，但是这个应该比较容易看出来，因为如果样品太酸的话上样液的色素
: 就会变绿色甚至黄色，很容易就注意到了。
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O******e
发帖数: 4845 | 10 stacking gel太短了，蛋白凑不到一块；太长了，你separation gel就短了。
【在 s******y 的大作中提到】
: stacking gel 一般不应该超过1厘米。什么因素决定我不知道
: 除了量大，样品里的盐分过多或者含有一些改变水结构的有机溶剂（比方说DMSO,
: guanadine) 也会让样品带涣散，和上样过多的结果类似
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s******y
发帖数: 28562 | 11 加点1M tris pH 8.8 buffer, 或者直接加一点稀NaOH
直到颜色变成蓝色
【在 p**i 的大作中提到】
: 好象颜色是有点类似绿黄色，那这种情况你是如何调的呢?
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s******y
发帖数: 28562 | 12 加点1M tris pH 8.8 buffer, 或者直接加一点稀NaOH
直到颜色变成蓝色
【在 p**i 的大作中提到】
: 好象颜色是有点类似绿黄色，那这种情况你是如何调的呢?
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p**i
发帖数: 3525 | 13 太感谢了! 从没注意到这现象，枉我做了这么多年蛋白实验。以前Bacteria蛋白表达，
提纯，结晶都没有这些问题。现在是用SDS Sample Buffer 洗Biotin Beads并浓缩后有
的这问题。
此外什么样的蛋白样品容易有pH的问题?
【在 s******y 的大作中提到】
: 加点1M tris pH 8.8 buffer, 或者直接加一点稀NaOH
: 直到颜色变成蓝色
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p**i
发帖数: 3525 | 14 是的，不过这回跑的大胶，这方面的考虑可以松一点
【在 O******e 的大作中提到】
: stacking gel太短了，蛋白凑不到一块；太长了，你separation gel就短了。
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s******y
发帖数: 28562 | 15 当然是酸性的蛋白容易有pH 问题啦。哈哈。
另外，你的biotin bead 里的残留液如果很酸的话也会带来问题。
又另外，你的biotin bead 里有没有类似guanadine or DMSO 这种东西？你是用什么东
西来
洗脱biotin的？ 因为在我的印象中，单纯的SDS-buffer 是不能充分打开biotin-
stravadin
的结合的。
【在 p**i 的大作中提到】
: 太感谢了! 从没注意到这现象，枉我做了这么多年蛋白实验。以前Bacteria蛋白表达，
: 提纯，结晶都没有这些问题。现在是用SDS Sample Buffer 洗Biotin Beads并浓缩后有
: 的这问题。
: 此外什么样的蛋白样品容易有pH的问题?
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T**********t
发帖数: 1604 | 16 SDS buffer加上煮沸应该是可以打开biotin-streptavidin的结合的。invitrogen的
dyna beads的说明书里我记得说过。
【在 s******y 的大作中提到】
: 当然是酸性的蛋白容易有pH 问题啦。哈哈。
: 另外，你的biotin bead 里的残留液如果很酸的话也会带来问题。
: 又另外，你的biotin bead 里有没有类似guanadine or DMSO 这种东西？你是用什么东
: 西来
: 洗脱biotin的？ 因为在我的印象中，单纯的SDS-buffer 是不能充分打开biotin-
: stravadin
: 的结合的。
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T**********t
发帖数: 1604 | 17 你的loading buffer是有pH缓冲能力的，如果你的样品最终pH不对，说明buffer缓冲能
力不够。一般SDS胶的loading buffer是用的cathode buffer的1/4浓度，你把它提高到
1/2或者更高好了。或者像sunnyday同学说的那样，直接加NaOH调上去。
【在 p**i 的大作中提到】
: 谢谢T兄，stacking gel浓度还是只有4%。那可能是样品的问题，protein standard 就
: 跑得挺快的。
: 那应该咋样调样品的pH和盐浓度呢? 总共就那么一点小体积
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p**i
发帖数: 3525 | 18 我也不知道这Beads是不是有带酸性的东西，一会查查instruction。我的目的不是洗脱
Targeting protein，而是和Targeting protein interact的proteins，所以SDS
Sample Buffer 应该可以了。
对了，你用过spin-X UF concentrator 吧。有的时候蛋白浓度很低却浓缩的很慢，是
不是也有pH的因素?
【在 s******y 的大作中提到】
: 当然是酸性的蛋白容易有pH 问题啦。哈哈。
: 另外，你的biotin bead 里的残留液如果很酸的话也会带来问题。
: 又另外，你的biotin bead 里有没有类似guanadine or DMSO 这种东西？你是用什么东
: 西来
: 洗脱biotin的？ 因为在我的印象中，单纯的SDS-buffer 是不能充分打开biotin-
: stravadin
: 的结合的。
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s******y
发帖数: 28562 | 19 我用过很多不同公司来源的concentrator,
浓缩慢的原因一般是：
１。膜的孔太小
２。蛋白带有糖基，太粘，把膜的孔堵住了
【在 p**i 的大作中提到】
: 我也不知道这Beads是不是有带酸性的东西，一会查查instruction。我的目的不是洗脱
: Targeting protein，而是和Targeting protein interact的proteins，所以SDS
: Sample Buffer 应该可以了。
: 对了，你用过spin-X UF concentrator 吧。有的时候蛋白浓度很低却浓缩的很慢，是
: 不是也有pH的因素?
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T**********t
发帖数: 1604 | 20 这种concentrator是靠离心力和滤膜来浓缩的，跟pH没什么关系吧。很慢是多慢？如果
浓缩得比正常的慢，可能是滤膜上的孔被堵上了。你的蛋白大么? 用的concentrator的
mwco是多高啊？
【在 p**i 的大作中提到】
: 我也不知道这Beads是不是有带酸性的东西，一会查查instruction。我的目的不是洗脱
: Targeting protein，而是和Targeting protein interact的proteins，所以SDS
: Sample Buffer 应该可以了。
: 对了，你用过spin-X UF concentrator 吧。有的时候蛋白浓度很低却浓缩的很慢，是
: 不是也有pH的因素?
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p**i
发帖数: 3525 | 21 是指提高Tris-Cl的浓度吗?
【在 T**********t 的大作中提到】
: 你的loading buffer是有pH缓冲能力的，如果你的样品最终pH不对，说明buffer缓冲能
: 力不够。一般SDS胶的loading buffer是用的cathode buffer的1/4浓度，你把它提高到
: 1/2或者更高好了。或者像sunnyday同学说的那样，直接加NaOH调上去。
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s******y
发帖数: 28562 | 22 除非是那个人工作的biotin analog,
天然的biotin 需要用6M urea + 2M thiolurea 来洗脱。
光用SDS-buffer 效果很差的。
【在 T**********t 的大作中提到】
: SDS buffer加上煮沸应该是可以打开biotin-streptavidin的结合的。invitrogen的
: dyna beads的说明书里我记得说过。
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p**i
发帖数: 3525 | 23 10 K 的孔，不能再小了。糖基有这么大的影响啊?
【在 s******y 的大作中提到】
: 我用过很多不同公司来源的concentrator,
: 浓缩慢的原因一般是：
: １。膜的孔太小
: ２。蛋白带有糖基，太粘，把膜的孔堵住了
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s******y
发帖数: 28562 | 24 不是，他是让你把４ｘbuffer 多加一点。
比方说１：２
【在 p**i 的大作中提到】
: 是指提高Tris-Cl的浓度吗?
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s******y
发帖数: 28562 | 25 １０Ｋ的膜过滤起来是比较慢。耐心点好了
【在 p**i 的大作中提到】
: 10 K 的孔，不能再小了。糖基有这么大的影响啊?
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p**i
发帖数: 3525 | 26 明明跑胶只能看见几个弱的条带，经常需要浓缩一天才能从2 ml到100 ul. 10 KDa
mwco.
【在 T**********t 的大作中提到】
: 这种concentrator是靠离心力和滤膜来浓缩的，跟pH没什么关系吧。很慢是多慢？如果
: 浓缩得比正常的慢，可能是滤膜上的孔被堵上了。你的蛋白大么? 用的concentrator的
: mwco是多高啊？
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T**********t
发帖数: 1604 | 27 是。就是让loading buffer的缓冲能力高一点。
【在 p**i 的大作中提到】
: 是指提高Tris-Cl的浓度吗?
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p**i
发帖数: 3525 | 28 明白了，例如把4X当2X用?
【在 s******y 的大作中提到】
: 不是，他是让你把４ｘbuffer 多加一点。
: 比方说１：２
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s******y
发帖数: 28562 | 29 你的蛋白多大？
【在 p**i 的大作中提到】
: 明明跑胶只能看见几个弱的条带，经常需要浓缩一天才能从2 ml到100 ul. 10 KDa
: mwco.
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T**********t
发帖数: 1604 | 30 效果也等同于把Tris的浓度提高了嘛，一样的。
【在 s******y 的大作中提到】
: 不是，他是让你把４ｘbuffer 多加一点。
: 比方说１：２
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p**i
发帖数: 3525 | 31 不知道，是未知的
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的蛋白多大？
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s******y
发帖数: 28562 | 32 对
【在 p**i 的大作中提到】
: 明白了，例如把4X当2X用?
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s******y
发帖数: 28562 | 33 在胶上和标准比较一下大概有多大？
【在 p**i 的大作中提到】
: 不知道，是未知的
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s******y
发帖数: 28562 | 34 在胶上和标准比较一下大概有多大？
【在 p**i 的大作中提到】
: 不知道，是未知的
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T**********t
发帖数: 1604 | 35 哦，我没比较过，因为我一般不需要把结合上去的蛋白再洗下来。
我就是看说明书上这么说的：
2.2 Release of Immobilized Biotinylated Molecules
The biotin-streptavidin bond is broken by harsh conditions. 5 mins
incubation at 65°C or 2 mins at 90°C in 10 mM EDTA pH 8.2 with 95%
formamide will typically dissociate >96% of immobilized biotinylated DNA.
Alternatively, boil the sample for 5 mins in 0.1% SDS for
protein dissociation.
Please note that proteins will be denatured by such treatment and Dynabeads
Streptavidin can not be re-used.
It has al
【在 s******y 的大作中提到】
: 除非是那个人工作的biotin analog,
: 天然的biotin 需要用6M urea + 2M thiolurea 来洗脱。
: 光用SDS-buffer 效果很差的。
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s******y
发帖数: 28562 | 36 在胶上和标准比较一下大概有多大？
【在 p**i 的大作中提到】
: 不知道，是未知的
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T**********t
发帖数: 1604 | 37 听起来是很慢。
我用GE的viva-spin，5K的mwco，从100多ml浓缩到1ml左右也就一天。会不会体积越小
越不好浓缩？我知道vivaspin的话，是有dead stop volume的，是为了防止样品浓缩干
，所以最下面没有滤膜，样品如果少的话，那么能利用的有效滤膜面积也就少了。
不过我从来没试过浓缩到100ul那么低，不知道是不是这样。
【在 p**i 的大作中提到】
: 明明跑胶只能看见几个弱的条带，经常需要浓缩一天才能从2 ml到100 ul. 10 KDa
: mwco.
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p**i
发帖数: 3525 | 38 有几条带，不知道那个是
【在 s******y 的大作中提到】
: 在胶上和标准比较一下大概有多大？
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p**i
发帖数: 3525 | 39 非常可能如你所说，并非样品本身的原因，而是体积太小。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 听起来是很慢。
: 我用GE的viva-spin，5K的mwco，从100多ml浓缩到1ml左右也就一天。会不会体积越小
: 越不好浓缩？我知道vivaspin的话，是有dead stop volume的，是为了防止样品浓缩干
: ，所以最下面没有滤膜，样品如果少的话，那么能利用的有效滤膜面积也就少了。
: 不过我从来没试过浓缩到100ul那么低，不知道是不是这样。
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s******y
发帖数: 28562 | 40 这个也有可能是因为你的蛋白把膜上的孔堵住了。特别是如果你需要
浓缩很多倍的话。
我们以前如果需要浓缩10倍以上的话，会使用那种倒置式的concentrator,
就是膜在溶液上方的那种，忘记是哪里买的了，好像是在fisher。
【在 p**i 的大作中提到】
: 明明跑胶只能看见几个弱的条带，经常需要浓缩一天才能从2 ml到100 ul. 10 KDa
: mwco.
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