T**********t
发帖数: 1604 | 1 我有几个mutate过的小蛋白，7k左右的分子量。在e.coli里表达的。site directed
mutagenesis之后质粒测序都是对的。表达出来的蛋白用质谱检测分子量，大部分都是
准的，但是有少数几个的测量分子量和计算分子量出现误差，分别差14，74和113。都
是测量分子量比计算分子量低。蛋白纯度很好，SDS-PAGE只有一个条带，质谱上也只有
一个主峰。请问这个误差可能是由于什么造成的呢？ |
K******S
发帖数: 10109 | 2 fragment them and get MS/MS Data
And how did you do the MS? What kind of instrument. Do you use average or
monoisotopic mass to make the calculation?
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我有几个mutate过的小蛋白，7k左右的分子量。在e.coli里表达的。site directed
: mutagenesis之后质粒测序都是对的。表达出来的蛋白用质谱检测分子量，大部分都是
: 准的，但是有少数几个的测量分子量和计算分子量出现误差，分别差14，74和113。都
: 是测量分子量比计算分子量低。蛋白纯度很好，SDS-PAGE只有一个条带，质谱上也只有
: 一个主峰。请问这个误差可能是由于什么造成的呢？
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b******n
发帖数: 4225 | 3 113的是不是少了一个aa残基啊
aa残基的平均分子量是110
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我有几个mutate过的小蛋白，7k左右的分子量。在e.coli里表达的。site directed
: mutagenesis之后质粒测序都是对的。表达出来的蛋白用质谱检测分子量，大部分都是
: 准的，但是有少数几个的测量分子量和计算分子量出现误差，分别差14，74和113。都
: 是测量分子量比计算分子量低。蛋白纯度很好，SDS-PAGE只有一个条带，质谱上也只有
: 一个主峰。请问这个误差可能是由于什么造成的呢？
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T**********t
发帖数: 1604 | 4 质谱我不熟，是别人带我做的。应该是MALDI-TOF。我不会做calculation啊，就是在
FlexAnalysis下面打开质谱图，在图上找那个最高的峰定位看分子量。对于质谱我所知
就这么多了。。。汗。
样品preparation什么的都是我做的，蛋白对PBS透析过夜，然后用0.1%的TFA溶液稀释
到10uM左右，再和Matrix（我记得是SA，不过不太确定） 1：1混合。加样上样都很简
单，但是仪器的setting都是别人弄好了现成的，我按按鼠标而已。再汗。。。
样品的分子量计算我是偷懒用在线软件算的，把蛋白序列输进去，计算出理论分子量，
我不知道它用的是average还是monoisotopic mass：
http://www.scripps.edu/~cdputnam/protcalc.html
我总共有14个样品，10个样品的主峰分子量都是对的，基本上是M或者M+1，但是有4个
样品差得比较多，其中两个低了14，一个低了74，另一个低了113。
【在 K******S 的大作中提到】
: fragment them and get MS/MS Data
: And how did you do the MS? What kind of instrument. Do you use average or
: monoisotopic mass to make the calculation?
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T**********t
发帖数: 1604 | 5 我想过这个可能性，但是分子量接近的氨基酸就这几个：
Pro: 115.000
Thr: 119.000
Val: 117.000
这些氨基酸在那个蛋白里倒是都有，但不在末端啊，如果是中间打断了，我觉得质谱上
应该是两个fragment的峰吧。
而且这个也解释不通少74和14的那两个mutant。
【在 b******n 的大作中提到】
: 113的是不是少了一个aa残基啊
: aa残基的平均分子量是110
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b******n
发帖数: 4225 | 6 呃，你得加上18才行
在蛋白质中间都是少了一个水分子的
也就是说分子量131左右的aa
比如ILE, Leu,Asn，Asp,
Ala: 89.000
Arg: 174.000
Asn: 132.000
Asp: 133.000
Cys: 121.000
Gln: 146.000
Glu: 147.000
Gly: 75.000
His: 155.000
Ile: 131.000
Leu: 131.000
Lys: 146.000
Met: 149.000
Phe: 165.000
Pro: 115.000
Ser: 105.000
Thr: 119.000
Trp: 204.000
Tyr: 181.000
Val: 117.000
至于14和74我也没什么想法
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我想过这个可能性，但是分子量接近的氨基酸就这几个：
: Pro: 115.000
: Thr: 119.000
: Val: 117.000
: 这些氨基酸在那个蛋白里倒是都有，但不在末端啊，如果是中间打断了，我觉得质谱上
: 应该是两个fragment的峰吧。
: 而且这个也解释不通少74和14的那两个mutant。
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T**********t
发帖数: 1604 | 7 谢谢，那就是这两个：
Ile: 131.000
Leu: 131.000
也都不在末端啊。
【在 b******n 的大作中提到】
: 呃，你得加上18才行
: 在蛋白质中间都是少了一个水分子的
: 也就是说分子量131左右的aa
: 比如ILE, Leu,Asn，Asp,
: Ala: 89.000
: Arg: 174.000
: Asn: 132.000
: Asp: 133.000
: Cys: 121.000
: Gln: 146.000
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T**********t
发帖数: 1604 | 8 哦，发现Asn也是这个range，那有可能少了一个Asn，那个蛋白的C端是个N，谢谢启发。
【在 b******n 的大作中提到】
: 呃，你得加上18才行
: 在蛋白质中间都是少了一个水分子的
: 也就是说分子量131左右的aa
: 比如ILE, Leu,Asn，Asp,
: Ala: 89.000
: Arg: 174.000
: Asn: 132.000
: Asp: 133.000
: Cys: 121.000
: Gln: 146.000
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h*****t
发帖数: 1226 | 9 MALDI-MS监测的平均分子量误差相对比ESI的大一些， 因为adducts的问题。
-14 Da有可能是-17 or -18Da (-NH3, H2O).
-74 和 -113可能是site chain或者terminal 的氨基酸掉了。
如果可能， 你可以把terminal的序列写出来， 大家可以看看。
不过你的分子其实很小， 7k应该误差相对较小。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我有几个mutate过的小蛋白，7k左右的分子量。在e.coli里表达的。site directed
: mutagenesis之后质粒测序都是对的。表达出来的蛋白用质谱检测分子量，大部分都是
: 准的，但是有少数几个的测量分子量和计算分子量出现误差，分别差14，74和113。都
: 是测量分子量比计算分子量低。蛋白纯度很好，SDS-PAGE只有一个条带，质谱上也只有
: 一个主峰。请问这个误差可能是由于什么造成的呢？
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h*****t
发帖数: 1226 | 10
这是calculated average mass.
【在 T**********t 的大作中提到】
: 质谱我不熟，是别人带我做的。应该是MALDI-TOF。我不会做calculation啊，就是在
: FlexAnalysis下面打开质谱图，在图上找那个最高的峰定位看分子量。对于质谱我所知
: 就这么多了。。。汗。
: 样品preparation什么的都是我做的，蛋白对PBS透析过夜，然后用0.1%的TFA溶液稀释
: 到10uM左右，再和Matrix（我记得是SA，不过不太确定） 1：1混合。加样上样都很简
: 单，但是仪器的setting都是别人弄好了现成的，我按按鼠标而已。再汗。。。
: 样品的分子量计算我是偷懒用在线软件算的，把蛋白序列输进去，计算出理论分子量，
: 我不知道它用的是average还是monoisotopic mass：
: http://www.scripps.edu/~cdputnam/protcalc.html
: 我总共有14个样品，10个样品的主峰分子量都是对的，基本上是M或者M+1，但是有4个
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h*****t
发帖数: 1226 | 11 C-term是N的话， 如果N和前面的氨基酸的肽键被打断， 你应该丢失132 Da (N+H2O)
发。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 哦，发现Asn也是这个range，那有可能少了一个Asn，那个蛋白的C端是个N，谢谢启发。
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T**********t
发帖数: 1604 | 12 -74那个我发现最终还是序列弄错了，site-directed mutagenesis的时候，somehow
single mutant弄成double mutant了。其他三个我反复又对了几次sequence，应该没有
错误了。
现在就是-14的这个，我不知道是怎么回事。会不会是掉了一个甲基？
【在 h*****t 的大作中提到】
: C-term是N的话， 如果N和前面的氨基酸的肽键被打断， 你应该丢失132 Da (N+H2O)
:
: 发。
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T**********t
发帖数: 1604 | 13 我用前面那个算mw的在线工具计算，如果把C端的N拿掉，计算出来的分子量和谱图上的
主峰是match的，主峰是M+1峰。你的意思是如果N是被打断的，丢失的应该是132而不是
113了？那也许我的蛋白在表达的时候就少了最后一个N？可我看sequence是全的啊。
【在 h*****t 的大作中提到】
: C-term是N的话， 如果N和前面的氨基酸的肽键被打断， 你应该丢失132 Da (N+H2O)
:
: 发。
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h*****t
发帖数: 1226 | 14 计算软件算的是完整蛋白， 蛋白碎片是不太一样的。。
http://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msproduct
你可以用这个算算碎片质量。
如果你在序列的最后有mutation, 是有可能造成stop codon的误读。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我用前面那个算mw的在线工具计算，如果把C端的N拿掉，计算出来的分子量和谱图上的
: 主峰是match的，主峰是M+1峰。你的意思是如果N是被打断的，丢失的应该是132而不是
: 113了？那也许我的蛋白在表达的时候就少了最后一个N？可我看sequence是全的啊。
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h*****t
发帖数: 1226 | 15 从你描述的现象看， 应该不是被打掉了什么基团，因为除非你的mutation
极大地改变了局部化学环境， 不太可能只有这一个分子掉甲基。
还是好好看看你的DNA sequence,会不会错。 还有， 有没有什么序列
可能被modify, 比如succimide的形成可能会造成丢失18 Da.
Gln或者 Glu被修饰成Pyro-glu 也丢失17-18 Da.
【在 T**********t 的大作中提到】
: -74那个我发现最终还是序列弄错了，site-directed mutagenesis的时候，somehow
: single mutant弄成double mutant了。其他三个我反复又对了几次sequence，应该没有
: 错误了。
: 现在就是-14的这个，我不知道是怎么回事。会不会是掉了一个甲基？
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n****e
发帖数: 1677 | 16 是des-met再加点别的什么修饰吧?
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我有几个mutate过的小蛋白，7k左右的分子量。在e.coli里表达的。site directed
: mutagenesis之后质粒测序都是对的。表达出来的蛋白用质谱检测分子量，大部分都是
: 准的，但是有少数几个的测量分子量和计算分子量出现误差，分别差14，74和113。都
: 是测量分子量比计算分子量低。蛋白纯度很好，SDS-PAGE只有一个条带，质谱上也只有
: 一个主峰。请问这个误差可能是由于什么造成的呢？
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T**********t
发帖数: 1604 | 17 谢谢你的链接。
根据这个计算的列表看，-113的峰应该是表达时就缺少了末端的N，而不是被打碎的蛋
白碎片。而且-14的峰也不能用蛋白碎片来解释。我想我还是重新sequence一下我的质
粒吧。
多谢指点。
【在 h*****t 的大作中提到】
: 计算软件算的是完整蛋白， 蛋白碎片是不太一样的。。
: http://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msproduct
: 你可以用这个算算碎片质量。
: 如果你在序列的最后有mutation, 是有可能造成stop codon的误读。
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