M*G
发帖数: 309 | 1 这个 外援比内源 好找的多啊
国内的中后卫 挨个数数 确实没有能 来的
靠 主要还是何 二愣子 太傻 B了 |
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d******k
发帖数: 4295 | 2 如果电影是国内源的话，有可能是国内公务员都开始上班看片了。 |
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s*k
发帖数: 144 | 3 【 以下文字转载自 ChinaNews 讨论区 】
【 原文由 greenwood 所发表 】
1.细菌人工染色体（BAC）是DNA插入片段可达200到300千碱基对(kb)
的人工克隆。
BAC系统比酵母菌人工染色体（YAC）开发得晚，后者有两个严重的缺
点，即容易
嵌合（chimeric）和不稳定（内源缺失）。这些文库用于物理作图（
physical mapping）。
大约在几年前，建造包含染色体或某段染色体区域的YAC，BAC和噬菌
体人工染色
体（PAC）的叠连群（contif）是一个热点。自几年前以来，BAC和PA
C叠连群被
用于基因组测序（即所谓预备测序叠连群）。现在人类基因组计划已
经完成了整
个基因组的测序，这些叠连群就变得不那么重要。
2.但是BAC文库用于荧光素原位杂交（FISH）工作还是有用的，也就
是说，如果
一个BAC克隆含有已知基因，就能用于FISH实验检测是否有该基因参
与其中。然
而，由于BAC很大而且可能含有其他未知DNA片段，即使用FISH检测到
了断裂信号，
也并不意味着该基因发生了变化。最后的结果还必须用分子遗传学的
办法确定，
即用Sout |
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E*G
发帖数: 22 | 4 类似想法我曾经在志愿者身上试过。不过，我并非是让志愿者"染"上甲亢，
而是用类似激素替代疗法的方法，给志愿者服用外源的甲状腺素。在小范
围的临床试验中短期效果并不明显。总结原因可能有：
1）肥胖病人本身可能就有代谢紊乱的问题，譬如说，肥胖病人身体中的脂
肪细胞上的胰岛素受体灵敏程度可能会有一定的变异，对血液中高胰岛素
的刺激过分敏感，而对血液中低胰岛素水平相对不敏感。这种胰岛素受体
的灵敏程度问题，不可能通过甲状腺素的水平来调控。
2）肥胖也可能是身体其它系统疾病的表现，是继发性或者医源性的。不治
疗原发病，是不可能彻底控制肥胖的表现的。
3）正常人的垂体-甲状腺轴是一个自我反馈系统，具有一定的自我调节的
能力，补充外源性的激素会抑制内源性激素的产生，最後机体还是会在新
的激素水平上达到平衡。
4）如果过量使用外源性激素，就要考虑激素可能的副作用，譬如说，突
眼症。这种不可逆的副作用是治疗过程中必须要避免的。另外，肥胖的人
一般循环系统负荷都比较重，而甲状腺素对循环系统的作用，会加重病人
的循环系统负担，所以，这种试验必须在医生的密切观察下，谨慎的进行。
在没有可靠的临床叁考值的情况下 |
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w********y
发帖数: 359 | 5 在生物学上，衰老与老化是两个完全不同的概念。衰老是有序的主动过程，是由内源因子
调控的细胞程序化死亡（programmed cell death）。而老化则是一个主要受外源因子影
响的非程序化的被动事件。间而言之，衰老也由基因控制的性状之一。
所有的高等生命在某个阶段都只有15%的基因表达，另外的部分处于休眠状态。某些特殊
的外界条件可激发部分休眠基因的表达，甚至产生变异，经典遗传学认为只有改变了遗传
物质的变异才能够传递给后代。米丘林学说则认为，遗传性传递的并不是性状，而只是一
定的发育可能性，是生命为了正常的生长发育对外界作一定反应的特性，既有继承上一代
的一面，又在每一世代中重新形成。基因物质的发现以及基因克隆技术的发展彻底否定了
米丘林学说。如果某物种不具备某基因，无论外界条件怎么刺激也不会产生某性状的表达
。就好象没有音乐细胞的人，无论怎样熏陶也于事无补。
生老病死，一切的一切，造物者本来早有安排。但基因图谱的完成，以及技术的发展使得
克
隆一切基因成为可能。也许某一天，花一点钱就可以转一个“不死”基因到身体里。实在
是喜欢音乐而熏陶许久未果的人也有机会成为莫扎特了。是不是这 |
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l*****a
发帖数: 1431 | 6 第二个问题：做EMSA选细胞要选没有内源蛋白会和promoter结合的细胞。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 7 可能是因为内源蛋白的量不够多，做出来的结果不漂亮呗。
这个当然可能会造成假象。 |
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d****u
发帖数: 1553 | 8 国内很多实验室一抗都用很久，以前我还见过用一年的呢，都变味了，一样用。不过这
些多半时HA，FLAG之类的抗体。
如果你是内源抗体检测效率又不是那么高的话，还是先摸条件的比较好。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 9 取决于你的目的啦
Talon基于cobalt跟his tag结合，
优点是不太容易被lysate里面的巯基乙醇，DTT等还原
跟E.coli内源的含his的蛋白(如SlyD)结合力弱，纯化效果好
缺点嘛，就是有时候跟目的蛋白都不能结合
Ni-NTA的缺点差不多跟Talon反过来吧
NI-NTA 和 Talon mental beads 相比， 纯化的效果那个好些？
谢谢！ |
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b****u
发帖数: 903 | 10 多谢各位的建议，crosslink我也曾经try过，就是重复不了别人的实验，人家内源也可
以pulldown，咱们overexpressing都不行，差距那叫一个大啊。
BTW，可能不同lab做COIP的时候的buffer条件不一样吧。 |
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p****n
发帖数: 9263 | 11 “ 理论上讲，脊椎动物的细胞含有调节适应性的免疫系统，它会杀死无法识别的异
己生物，因此藻类想要固定地共生在蝾螈细胞内部几乎不可能。而研究人员对这一新发
现的解释是，要么蝾螈的细胞关闭了自体免疫系统，要么藻类有效避开了这一免疫机制
。”
这段话很有问题吧，只要是在免疫系统发育初期就存在的，在免疫系统眼里就是“内源
性”的而不会被杀死。难道俺的免疫学基本概念错了？ |
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c*v
发帖数: 151 | 12 内源天然激素在体内的半衰期应该非常短，要不然不能满足激素快速准确调节机体功能
的要求，用在肉用动物中的激素可能会有一些修饰使他们作用的时间长一点，不过也不
会长到哪去，最多几天十几天吧 |
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p********i
发帖数: 116 | 13 想要看一个蛋白是否定位在内质网上面，需要看内源的，但是看到invitrogen的er-
tracker固定后会有信
号的衰减，请问我要是用个蛋白做ER的marker，用哪个最好呢？谢谢。 |
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y******8
发帖数: 1764 | 14 内源的膜蛋白可能很难做。比较常见的是做FRET或者Co-IP，都是过量表达。 |
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z********i
发帖数: 610 | 15 1.看到有帖子说细胞污染的事情，我也有遇到了很奇怪的事情。我的细胞养时间长了以
后，比如2-3周，形态会发生很大的变化。比如Hep3B会变成293T那样的形态，不知道是
不是因为细胞污染的缘故？
2.我手上有一个蛋白,当我用GFP-tag去看定位，发现呈现点状定位。如果用FLAG-tag则
是弥散的（没有内源的抗体）是不是因为GFP dimerization影响了它的定位呢，或者是
因为TAG太大的原因？
谢了 |
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C******r
发帖数: 790 | 16 我也是约来越不会做western了
在以前实验室，从没做过的三四个内源蛋白CoIP，一次就能做出来
现在实验室，这次有的信号（doublet磷酸化band）下次就没有了（只有脏背景，没有
条带），搞得我每次去显影都提心吊胆
即使cell line相同，抗体相同，稀释倍数相同，一个人western跟另一个人western不
一样的可能原因太多了，试着列举一下：
1、cell lysis buffer的离子强度和去污剂强度不同，裂解时间长短不同，导致你们
lysate里的蛋白种量有差异；至于要看磷酸化band的话，裂解液是否加phosphotate
inhibitor, 加的种类，也超级影响结果。我不加phosphotase inhibitor的话，有时候
可以看到band shift，但更多时候看不到。
2、SDS胶的浓度，Tris的浓度和pH；这个有人说有影响，我还没有比较过。
3、转膜的电流、时间、温度，以及转膜液里的离子强度（Tris和Glycine的量）,以及
是否加有SDS，都会影响转膜效果。个别抗体对转膜有没有SDS会很敏感，没有哪个配方
是绝对的好。
4、一抗和二抗的稀释倍... 阅读全帖 |
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m******5
发帖数: 1383 | 17 这篇文章从头到尾都是在消化道中检测啊，而且不光是transgenicDNA，还有植物内源
DNA
文章主旨就是说外源DNA会survive到消化道尾端，并且被肠上皮吸收和消化
而这种消化方式 ‘was with no evidence to suggest that recombinant DNA would
be processed in the gut in any manner different from endogenous feed-
ingested genetic material’
民科们能不能花钱请人把文章读懂了再出来吠啊 |
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m******5
发帖数: 1383 | 18 小弟刚从生化转到发育领域玩
目前正在做一个Homeodomain protein,查10年来的相关的发育领域的文献（DB,
development）非常奇怪地发现都只有in situ 检测蛋白表达和分布，没有免疫组化，
也没有western
我试了市面上所有commercial抗体，也都不能在组织里检测到（western 和免疫组化）
作为阳性对照，转293 overexpress的蛋白检测起来都是没问题的
PS ：我做组织裂解液是用RIPA+超声打散的办法（组织在RIPA buffer里沉淀后直接用
超声打匀，反复三次），理论上也应该没问题？
求指教！
另外还有一个好奇的地方：很多做发育的文章也都只用ｉｎ ｓｉｔｕ来说明问题，这
是什么原因呢？ 是因为组织里免疫检测不到很正常？
另外，没有蛋白水平的检测能说明问题么？ 比如可能蛋白质已经被truncate 了 ，或
者蛋白质aggregate了 ，或者被调控降解了 ，这些都是不能用简单的insitu来证明的
吧？ |
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w***e
发帖数: 269 | 19 A simple but not very helpful answer is perhaps the antibodies are not very
good. |
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m******5
发帖数: 1383 | 20 you think my procedure attached for tissue lysate preparing should be OK?
I also tried TCA precipitation to concentrate tissue protein, but it still
didn't work
very |
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w***e
发帖数: 269 | 21 Yes, I think your tissue lysate preparation is fine. That's how I do it too. |
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S*******m
发帖数: 34 | 23 有一些蛋白在正常组织里边就是这样的.正常情况下表达很低.只有在某些情况或某些组
织里面才高表达.
参考p53,c-Myc,progesterone receptor. |
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v***a
发帖数: 1242 | 24 我也遇到过类似的问题。一个蛋白，很少有paper是IB直接检测到的，大部分是IP再IB
。但我重复不出来。试了无数个抗体。有一个好的，能IB检测到，条带非常清晰漂亮，
跟PCR结果吻合。但过了1、2个月，这个抗体也不work了。再从那家公司买（试过同一
lot或不同lot），也都不work。所以我以前得到的result也都无法重复了。我不知道是
不是这种抗这种蛋白的抗体有某种特性的缘故。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 25 先ip再ib有reference么？ 查了一会儿都似乎有些语焉不详……
IB |
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e*r
发帖数: 103 | 26 这两种手段，如果用的启动子比要敲低基因的内源启动子要弱，是不是效果就很差？ |
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y**********o
发帖数: 37 | 27 最近老板忽然对Alzheimer's disease产生极大的兴趣,非要把课题往这个方向上靠.我
研究了几篇综述后,有些最基本的问题想请教一下版上做这个方向的高人.相信这里应该
有很多前辈能够指导一下我这个外行,晚辈先在这里感谢一下所有回帖的.
问题一,目前市面上各种mouse models似乎都是转了human mutated genes,像APP,PS1什
么的.最常见的检测指标是A-beta和NFT的染色. 老鼠也有内源性的APP和Tau, 好象内源
性的Tau所形成的NFT在小鼠中一直无法诱导,那么内源性的APP可以经诱导产生A-beta斑
块吗? 公司能买到针对rodent的A-beta抗体, 说明有这种可能,只是主流的文章似乎都
在关注human gene product.有没有可能用老鼠内源性的APP来做疾病模型?
问题二,目前主流的观点对这个疾病的机理是否偏向于Ca overload? 我们手头现有的
mouse model显示reduced cytoplasmic Ca concentration,类似PSI/PS2 KO 模型,但这
个似乎无法被牵强的说成Alzhe... 阅读全帖 |
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z********i
发帖数: 610 | 28 MS找到了两个相互作用的蛋白。最初克隆基因的时候发现不容易做出来，不得已用了
Taq酶，测通之后发现有四个点突变（K and E都有)，当时没有太在意，就这样做下去
了，发现有很强的相互作用。克隆的这个基因是kinase，做了KR突变之后,发现KR和WT
的作用一样(reporter assay)，我心里就有点疑惑了,当然kinase-indepdent的效果也
是有可能的。内源的相互作用没有做，在没有拿到confirmed的data之前，估计老板也
不会买抗体。
期间用pfu还是把这个基因克隆出来了，重复了一下原来的实验，发现重复不出来以前的结果，相互作用很弱，可有可无的那种。
难道我以前看到的是假象吗，真有这么点背的吗？ |
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s*********t
发帖数: 600 | 29 用来做293FT和ES细胞的内源的MeCP2的western blot／
我用了abcam的，号称ChIP级，但是好难用啊／
还有，这个MeCP2的human和mouse的两个的isoform分子量计算的都在53kD左右，怎么WB
检测的都是75kD呢？差的
也太多了吧？为毛啊？
谢谢！！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 我其实不是作imaging 技术的，不过作为一个user 还是很关心里面的发展。
晓薇的地位当然还比不上晓亮，晓薇出道比晓亮晚得太多了，和Hell更是不能比。
之所以把晓薇和晓亮放在一起说，是因为上面把他们两的名字一起提出来了。
这不都说晓亮都要拿院士了么？而晓薇。。。还嫩着呢。
Stephan Hell 算是超级分辨率显微镜的开山老祖吧？
但是STED的机器复杂，价格昂贵，而且容易把样品bleach, 所以一直推广不开。
PALM和 STORM原则上是一样的，唯一的差别就是PALM 是用荧光蛋白fusion 发展起来的
，但是这个其实我们做细胞生物学的人看起来不是特别好，因为太麻烦，
而且fusion protein 和内源蛋白并不能保证一样。在这个意义上，使用dye的
STORM 更方便一些。不过，话又说回来，这两个技术其实几乎是一样的，
使用的染色方法完全可以互换（只要使用适当的激光源）
的主页
Betzig近来
了。只是
的大作罢 |
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t****p
发帖数: 1504 | 31 我以前也曾看到类似现象，就是一个蛋白有两带，大的用genome sequence怎么解释都
不通，比预计的条带（小带）大20kd左右，后来用sumo，磷酸化啊，糖基化啊一一检测
过去，什么都不是，现在还是不知道什么原因。
还碰到一个情况是把内源蛋白交联，发现有多一条带，大20kd左右，以为交联到了新蛋
白，质谱打了两次，除了这个蛋白序列外没有其它的。问不少人，都说构象的变化导致
20kd的迁移从来没有出现过。迄今为止还没有很让我信服的解释。 |
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g*********d
发帖数: 233 | 32 RNA干扰及其在动物繁殖中的应用
2009-12-28
RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通
过 RNA 调控基因表达的机制, 它是指在真核细胞中引入双链 RNA分子从而导致具有序
列同源性的基因产生特异性基因沉默 (gene silencing)的现象 。由于 RNA干扰可以阻
断特定的基因表达, 具有超越疫苗和抗病毒药物的诸多优点, 因此在阐述基因功能以及
蛋白质相互作用等方面, 表现出诱人的前景。近年来随着分子生物学的发展, RNAi 的
机制也不断被阐明, 同时国内外研究也证实 RNAi 技术可以为动物繁殖过程中所涉及的
基因功能提供一条新的思路, 这在科研和生产实践上都具有重要的意义。
1 RNAi的发现
Matzke 等于 1989 年报道了启动子介导的序列同源性基因共转染烟草可引起转
基因表达发生沉默。 1990 年, Napoli 和 Van der Krol 等为了让矮牵牛花的颜色更
加鲜艳, 把与紫色相关的查尔酮(chalcone)基因转染到牵牛花内, 结果意外发现, 植物
体的颜色... 阅读全帖 |
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m*********n
发帖数: 215 | 33 重新转化，挑单克隆然后测序。如果你的插入序列是pcr来的话，测序需要设计primer
把插入序列的全场都测过。还有你用的细胞系内源表达此担保么？ |
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S******e
发帖数: 393 | 34 个人几点想法：
1）confirm constructs 正确
2) 质粒最好纯度要高，至少不要太差
3）转化效率要高
如果蛋白较大，转染后即使有表达（比如检测tag), 但量不够，
这时用内源蛋白抗体检测时就不一定能看到差异,正如你所说的与control比没变化。
如果你的构建加tag了，就检测一下看是否已表达了，若已表达那就想办法提高转化效
率吧。
(另外还想到的是加inducible 的promoter诱导时间长一些，不知是不是可行，仅供参
考） |
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