m**1
发帖数: 2 | 1 我想用Lentivirus介导针对某一基因ShRNA感染U2OS细胞以Knockdown该基因的表达，结
果是反复几次均未成功----感染U2OS细胞后用Puromycin筛选，细胞全部死亡。这说明
可能1）Lentivirus没有包装成功2）U2OS对Lentivirus敏感3）----？
我有该种Lentiviral表达质粒直接用Fugene
6转染U2OS细胞，然后用puromycin
筛选，有大部分细胞survival,说明Lentiviral表达质粒没有问题。
我包装Lentivirus的过程是：
Co-transfect下列质粒至 293T 细胞（用Fugene
6），48小时后，将上清液过滤，直接加到U2OS细胞上，48小时后加入Puromycin进行筛
选。
Lentiviral质粒 5ug
Gap 2ug
Rev 2ug
VSVG 2ug DNA总量 11ug, Fugene reagent 33ul.
第二次加大了DNA量，但还是不成功。
Lentiviral 质粒 10ug
Gap 3ug
Rev 3ug
VsVG 3ug DNA 总量19ug,Fugene 57 |
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m**1
发帖数: 2 | 2 因为Lentivirus感染U2OS cells的效率高，~ 98%; 而Fugene转染效率为~70%.因为我最
后的实验要用FACS来做，所以我希望几乎所有的细胞多能感染。 |
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s******u
发帖数: 81 | 3 似乎你的“感染”方法效率不高，可以试试concentrate virus, 然后转染with
polybrene提高转染效率 |
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y*******i
发帖数: 96 | 4 用fugene 6能转染成功为什么还要包装成病毒，再去感染细胞呢，我真的不懂，很想知
道答案．多谢！ |
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发帖数: 1 | 5 中国足协U20选拔队球员以客队身份，首次参加在美因茨举行的德国西南地区联赛。在
比赛中，由于观众席上有人挂出“藏毒”旗帜，中方队员随即退出赛场。期间，一名中
国球迷冲上前去试图夺走“藏毒”旗遭到阻拦。赛后，德国足协竟称球场“有言论自由
”，并呼吁中国球员“淡定”。随后中国足协与德国足协进行了多轮交涉，但德国足协
仍不能向中方保证以后不再发生此类事件。因此在26日，中国足协宣布中断与德国足协
的合作，并召回U2O球队。藏D也好，台独也罢，事关国家核心利益，别说小小的德国，
就算是美国来了，那也没有商量的余地。大约挪威首相十年前接见了达L，被中国人关
了十年禁闭，闹得挪威驻华大使十年不敢回国，今年大访芬兰期间，才取得中国谅解，
随后挪威首相访华，两国关系开始破冰。可能这个教训还不够深刻，中国还需要多给那
些干涉中国内政，破坏中领土与国家主权完整的西方国家人士更狠的打击报复。
当然报应来得很快，因为中国手里的牌实在够多。就在中国召回U20球队的当天下午，
强哥应邀访问匈牙利并出席中国与中东欧国家领导人峰会（又称16+1峰会，即16个中东
欧国家领导人与中国领导的对话峰会）。当强哥的专机抵达布... 阅读全帖 |
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J********3
发帖数: 3151 | 6 我们也是从addgene买的，因为没认真做这个，就是大概齐建立个方法以备将来用，还
真没观测过荧光，不过293T跟MEF表达水平差太远，肉眼几乎看不见荧光也正常，俺以
前用U2OS做GFP-tag的稳定细胞株，初期能看见很绿，到挑克隆时也基本看不清了，但
用FACS能sort。俺的primary MEF是3/48的iPS，比永生MEF少几倍，俺们lab另一个人是
0/96，俺也不大清楚他为啥就不灵。
实在不行，可以把培养基里加点GSK-3 inhibitor，俺加了2i，90%以上的胚ICM能诱导
出ES来，不加的话，也就30-50%的胚ICM能诱导出ES来，这个不是简单的两三倍差别，
应该是非常大的差别。
293T |
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S******e
发帖数: 393 | 7 cDNA加载体约20kb, 转染Hela, 293, U2OS, 我试了lipfectamine2000, 效率很低，表
达及其微弱，请问有人转过大质粒吗? 除了电转外有好的方法吗？ 多谢！ |
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S******e
发帖数: 393 | 8 Hela, U2OS
用的lipofectamine RNAiMAX |
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f*********8
发帖数: 129 | 10 谢谢。
我做的是U2OS,刚transfect了一星期，还不知道怎样。如果有多一点的resistant
clones那还好。后面会用western鉴定。就怕最后一个都没有，又要重来。 |
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p*******l
发帖数: 24 | 11 哪位有经验的说说，
该种多少细胞 （我用U2OS）？
是不是很难把细胞在chamber里均匀铺开（面积小）？
多谢指教。 |
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h******y
发帖数: 351 | 12
Try U2OS, you would love it. |
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t******y
发帖数: 716 | 13 HeLas cell 和U2OS细胞形态比较好，比较适合用于显微镜拍照。 |
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m**********d
发帖数: 137 | 14 想问问这几个line对于 TGF-beta的反应怎么样 |
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c********r
发帖数: 1125 | 15
制？
居然这么冷门的小领域也有人关注，感动一下，再出来献丑一下。。
1垂直这个怎么研究
－我也没啥主意，知道的是如果用laser打掉centriole中的一个的话，再生的
centriole的budding site貌似是随机的，但是就是垂直。。。。Ucsf的wallace有写过
跟这个问题有关的综述，不过基本是忽悠。。
2。reduplication是指的在某些特殊情况下的过度复制，比如已知cho/u2o细胞如果阻
断在S期，centirole 会进行疯狂复制，或者打掉daughter centriole 也会导致mother
centriole 的过度复制，原因我记得是跟plk-1的活性有关。
3.如何区分药物影响的是更早的细胞周期检验点checkpoint还是直接影响centriole复
制？
-看FACS的结果，有没有S,g1,g2的prolong.
4。质谱检测的centrosome是如何富集得到的？
－centrosome 有专门的纯化分离方法，在不同系统里面都挺成熟了，但是还有很多细
节还没有特别标准化，比如如何在提取过程中保持centriole 的cartwheel结... 阅读全帖 |
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r***e
发帖数: 2539 | 16 很多做p53的人用U2OS。
p53做了以后发文章也难，除非你老板是圈内人士。 |
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C**S
发帖数: 522 | 17 图片是U2Os GFP－LC3细胞，还没有给予starvation。以这个图为例，有很多问题，一
一求教
1：如何定量。大家用软件还是手动数，软件的话有什么软件推荐？
2：还是定量问题：看到说autophagosome大小在0.5－1.5uM，照片上的很多小点是小于
这一值的，是不是只数大于0.5uM的？
3： 怎么解决heterogeneity的问题。看autophagy文章error bar都很小。怎么培养细
胞才能减少对照细胞的autophagy？ 同样的问题在starve之后也存在。
4：细胞在EBSS里starve6小时，也没看见GFP puncta明显增加，是不是有什么没有注意
到的问题？还是在这个荧光定量的实验中，大家都是默认加inhibitor的比如bafA1，即
使实验方法中没有明确说明？
预先感谢大家能够一一解答。 |
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z********i
发帖数: 610 | 18 我就是这么做的，用HELA U2OS细胞。有一些文献上列出来的数据是70%左右，而我看到
的很少。
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