l******9
发帖数: 579 | 1 【 以下文字转载自 JobHunting 讨论区 】
发信人: light009 (light009), 信区: JobHunting
标 题: IIS7.5 大于 64KB 文件不能下载 ?
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jun 23 12:47:53 2015, 美东)
大于 64KB 文件不能下载 (from C# code). 大于 文件不能完全下载， 只能下载 64KB
， 然后
truncated. Why ?
I have published a web service application (C# built in VS2010) to a desktop
with IIS 7.5 win7.
The web service has been hosted successfully on win 7.
Now I can install the application on my laptop (win 7) by accessing the URL
http://myDesktopName.domain.com/MyApp/MyAppSetup.msi
... 阅读全帖 |
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l*****e
发帖数: 3343 | 2 微软真糙蛋，我今天下班鼓动了三个小时才搞明白，为什么我的win7不能升级到win10,
以下是通过google搜到的好用的几个方法，去解决三个不同的错误信息！！！！！希望
对大家有用！一定要升级到win10,为了安全起见。。。
Error1: Failed to install, because windows can’t fail some critical updates
- goto Step9
Error2: Windows 10 upgrade couldn’t update the system reserved partition -
goto Step1
Error3: Shown in windows update, error code-”WindowsUpdate_80240020” -goto
Step7
1. press win+r and type diskmgmt.msc
2. System partition (no drive letters) listed at 100MB, right click on it
and go to change dr... 阅读全帖 |
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y**3
发帖数: 267 | 3 The title was truncated.
University of Minnesota twin cities |
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n*******e
发帖数: 27 | 4 yeap, man, it is like that you first have to make a DNA
competitor that can be amplified with the same primer
sets. however, the size of the product is different than
the RTPCR product, normally it is 30-100bp less than
that. so it is an internal deletion of the RTPCR product.
then you add different amount of the competitor to the
RT product, and do PCR. run the gel through a machine,
sort of like HPLC. there should be three major products,
the cDNA, the truncated cDNA, as well as a hybrid of
th |
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b*******r
发帖数: 179 | 5 the other thing is
you can try coexpressing the same protein
but use truncations
like you expresses the 20kd fragment
and then expresses the other 20kd fragment as well
and put them together
some times if the two domains are tightly linked
and just have a small flexible linker
some times if u just coexpress them together
they end up touching each other enough
in all honesty
if you doing crystallography
he should just do the two fragments and put them in the xtal tray
as long as you wait for the |
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b*****o
发帖数: 150 | 6 序列和别人paper上一样有什么不对么
即使不一样也正常
要想设计truncated蛋白 在截断的位置上inframe加入一个TGA不就成了么? |
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F*K
发帖数: 608 | 7 同时构建一个基因的3个truncation mutant，
mini prep做出来都挺好，序列也都正确
可是只有一个能maxi prep出来，其他两个重复了几遍，都提不出DNA
百思不得其解，请板上的各位同修指点一下。不胜感谢！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 8 嗯，其实我具体也不是做这个的，但是经常听讲座，他们有些做
AD的对这个amyloid的假说有很强的怀疑。他们觉得那个更像是病症而不是
病因。
我现在在想，难道没有人做过这样的实验？就是在老鼠脑子里面强行
表达一个肯定会沉淀的amyloid 蛋白的mutant truncate protein,看看
是否会直接导致AD?
有没有其他同学来具体讲一下？
amyloid
过。
plaque |
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H****N
发帖数: 997 | 9 It depends. If the rest of the mRNA is still in frame, a truncated protein
can still be produced. Remember that lz does not have definitive evidence
that a protein can still be produced from the ko allele. |
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l********n
发帖数: 62 | 10 查了一下这个甜菜品种GTSB77
“The plasmid used during the transformation of this sugar beet line also
contained a second gene that encoded the enzyme glyphosate oxidase (GOX)
from the bacterium Ochrobactrum anthropi. This enzyme was intended to
accelerate the normal degradation of glyphosate into aminomethylphosphonic
acid (AMPA) and glyoxylate in plant cells. Upon insertion into the plant
genome, the GOX encoding gene was truncated and fused to genomic sugar
beet DNA sequences, resulting in a chimeric sequ... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 可以有很多种情况啊。
比方说他们敲的时候只是敲掉了第一个exon,但是其他exon东剪切西剪切之后
在某个条件下又剪出一个有活性的truncate了 |
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f*******e
发帖数: 354 | 12 KO 有很多种：Conventioanl KO，可能会出现truncate
conditional 一旦cre表达不全或不过 确实可能KO不全
inducible的那就更有可能了
移植的肿瘤后有表达？
是移植了KO的肿瘤还是一直到KO的小鼠，这样两种细胞有一种不是KO就嘛事就有可能了
啊？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 13 小弟刚从生化转到发育领域玩
目前正在做一个Homeodomain protein,查10年来的相关的发育领域的文献（DB,
development）非常奇怪地发现都只有in situ 检测蛋白表达和分布，没有免疫组化，
也没有western
我试了市面上所有commercial抗体，也都不能在组织里检测到（western 和免疫组化）
作为阳性对照，转293 overexpress的蛋白检测起来都是没问题的
PS ：我做组织裂解液是用RIPA+超声打散的办法（组织在RIPA buffer里沉淀后直接用
超声打匀，反复三次），理论上也应该没问题？
求指教！
另外还有一个好奇的地方：很多做发育的文章也都只用ｉｎ ｓｉｔｕ来说明问题，这
是什么原因呢？ 是因为组织里免疫检测不到很正常？
另外，没有蛋白水平的检测能说明问题么？ 比如可能蛋白质已经被truncate 了 ，或
者蛋白质aggregate了 ，或者被调控降解了 ，这些都是不能用简单的insitu来证明的
吧？ |
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w**t
发帖数: 52 | 14 我遇到过好几次用Ecoli表达真核蛋白都是truncation，
应该是codon bias的问题，用Rossetta能好一些。
或者换insect cell。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 15 没做过。不过我猜用LNA，PNA这类探针，一个设计在
truncation里面，一个设计跨在两边 |
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W****C
发帖数: 1937 | 16 我在做一个２０ｋｄ的蛋白，发现它很容易被降解， 半衰期大概２－３小时。 而且
这个蛋白的truncated/mutated clone 转染细胞后多数都测不到蛋白表达（全长的做
＋对照可以测到）， 但是能用invitro translation的系统测到。小蛋白容易降解？
这种现象常见吗？
我现在先测它是不是+ubiquitin，proteasomal degradation. 其他降解途径比如ｌｙ
ｓｏｓｏｍａｌ， ｐｒｏｔａｓｅ， ｃａｓｐａｓｅ比较好用的ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒ有啥(用来处理细胞）？ |
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z****g
发帖数: 972 | 17 我一般搞两种，一种是whole genomic DNA(包括从promoter到stop codon前)+GUS
另一个就只是promoter+GUS. 当然你也可以用不同的truncated genomic DNA+GUS |
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y***i
发帖数: 11639 | 18 重要的点突变能。当然truncated protein更容易做，点突变工作量大但说服力更大
一点。
可以从保守氨基酸中找重要氨基酸。蛋白已经有结构，或者相似的蛋白有结构，也可
以尝试从结构上猜测重要氨基酸。 |
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w********r
发帖数: 1431 | 19 无语了，好多人真是擅长把简单的问题复杂化来显示自己的渊博...
你们最早是用什么Assay发现AB结合的？
那你就继续用这个Assay(不管是co-ip还是pull down还是NMR还是荧光啥高科技)，
根据已知的AB的结构做各种truncation/deletion（避免蛋白misfolding）,
继续用你的Assay检测，就知道那个部分是负责结合的了 |
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H*g
发帖数: 2333 | 20 I do have plasmids that encode different truncated form of my protein.
I would try with those, thanks a lot!
toxic |
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g*********r
发帖数: 9366 | 21 有的地方有相当好的resource
有的地方有cloning facility, high throughput crsytallogrphy screening
facility
你拿来coding sequence，你说要放到什么vector 里面，histag, GST tag, mbp tag
同时尝试， 要什么mutant/truncation , 几种选择，一个礼拜交活，你拿走plasmid,
然后你拿去fermentation facility长
回去自己纯化， 然后robot setup box， robot inspection,
没有这些的结构小组，是无论如何不会有竞争力的 |
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g*****p
发帖数: 451 | 22 这年头做蛋白的人怎么这么多...
你这个蛋白问题挺大的，本来性质就不是特别稳定，不容易在溶液中单分散
由于你用了gst，所以使其溶解性能增加了
你的gst beads实际上是agarose尾巴上接14C左右的碳链
然后再锚定谷胱甘肽
你的蛋白如果疏水区外露的化，很容易就跟这些碳链骨架的beads搅合在一起了
所以你的gst能带着就尽量带着吧
不过gst是一个dimer，如果你的蛋白活性对聚集状态没有什么要求的化，就用这个好了
如果有要求可以换个mbp啥的
如果纯化出来除了做做pull down等等还有其他要求，比如mg啥的
最好还是做些mutant,truncation也行，fusion protein, 也行，把hydrophobic
residue
一路突变过去找个不影响活性又能增进其稳定性的亦可以
BTW:你这个蛋白我怀疑已经是soluble aggregate了，最好还是先不去除tag，把蛋白稍
微纯化一下，用gel filtration或是光散射看一下
soluble aggregate对你没啥太大意义了，就算测出来点活性。以后成文，你要在文章
里耍赖不提还好，一旦提到sol... 阅读全帖 |
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f*********e
发帖数: 24 | 23 Relation between MeCP2 and Rett syndrome
1999-10 Nat Gen Huda Y. Zoghbi Rett syndrome is caused by mutations
in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2
Mouse models: whole-body knockout, brain-specific, brain-region-specific,
knock-in,..., over-expression, rescue, ...
2001-03 Nat Gen Adrian Bird A mouse Mecp2-null mutation causes
neurological symptoms that mimic Rett syndrome
2001-03 Nat Gen Rudolf Jaenisch Deficiency of methyl-CpG bindi... 阅读全帖 |
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s**e
发帖数: 1523 | 24 老板让我找一个比较universal的secretory signal sequence用来表达一个蛋白（其实是
truncated的，它的细胞外的部分），然后看它在ECM里面增高之后对细胞的影响。我找
了半天都是细
菌、酵母、insect cell之类的表达比较多，直接用人类细胞表达的很少，有具体
signal
sequence的就根本没找到了。我是刚换了工作，所以对这个领域不是很熟悉，查了
pubmed上的文献，
都是蛋白自带的signal sequence，没有人工进行表达的。请大家给我指点指点，或者
给推荐个文章
看看吧！谢谢了！ |
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j****x
发帖数: 1704 | 25
一般设计KO的时候都会考虑这个因素，不大可能保留truncated protein的表达，一般
就是无关序列很快有stop codon终止。
目前对于一般商业化的chip，如果出现你说的这种非特异性，这个芯片基本也就不要卖
了。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 26 Thank you much for your great contribution to my rookie question^^
I think non-related region negative control is convincing theoretically, if
not taking non- specific DNA precipitation into account: different DNA
region might have different tendencies of non specific precipitation (I also
learned that this issue can be simply avoid by using dynal beads)
A parable phenomenon is that when I was doing invitro protein interaction
assay such like GST pull-down and co-ip, the reviewer did not questi... 阅读全帖 |
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T*****n
发帖数: 274 | 27 其实也要视实际情况。比如knock out target gene的一个exon by introducing
frameshift and stop codon (对于很多很大的基因来说，这样做很常见），如果
RT－PCR的一条引物在敲掉区域，肯定是检测不到mRNA的；但实际上target
gene有可能表达为truncated/mutated form，这样子的话RT-PCR就会出错。
这种情况下，RT-PCR引物扩增没有delete的片段更加可靠,它可以明确告诉你target
gene是否有表达为任何形式。
当然，最可靠的手段还是southern和western。 |
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S******e
发帖数: 393 | 28 补充一下，有些试验比如co-IP也没有人会triplicate吧，
我做IP时重复了好多遍阿，反过来正过来，然后truncated。
反正好多试验都花了很多的精力与时间，或者说大量的工作。 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 29 你要in vivo做的话，弄个truncation不就完了 吧GC catalytic domain去掉 |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 把那个蛋白两头联上不同的tag, 双重纯化得到全长的纯蛋白，然后在不同
温度，不同蛋白浓度和离子条件(such as with EDTA, with Mg, with Ca)
下观察是否会出现truncate.
然后再往后细化条件。 |
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s*******e
发帖数: 1010 | 31 你可以把你拿到的truncated蛋白送去做质谱吗？如果能确定降解的位点，做个突变可
能抑制你目标蛋白的降解（质谱测不出就根据分子量来猜，做个Ala scan）。如果能够
成功地拿到抗酶切的全长蛋白，可以把它当作成一个蛋白酶来测试，像三楼说的那样，
合成一些降解区域序列的多肽来检测你目的蛋白的蛋白酶活性。 |
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l******g
发帖数: 1623 | 32 想过是不是hydrolysis, 我感觉自发hydrolysis是比较慢的反应, 今天作了个试验, 把
蛋白从pH8.5 稀释到pH4的buffer里, 5分钟内所有蛋白都变成truncated了 |
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g*****p
发帖数: 451 | 33 这个问题不难回答
从你以前的帖子已经知道你找到了酶被水解的位点
那你只需要合成一段相关的底物就可以了
然后还可以标记一下荧光，加点酶，看能不能切
要是能切的话，连kcat/km都可以算出来
如果能切，一般来说trans-leavage和cis-cleavage的认定才是
最头疼的事
一般来说得需要做个核磁或者晶体结构才行
要是你能拿到zymogen的结构呢，这个是比较好回答了
但你也说了这个酶不稳定，你想拿到zymogen的结构不做几个点突变把它稳定住
是不行的
不过现在为止你的实验数据有点让我困惑的地方（我不是说你的实验数据不对，只是说很
难解释这个现象，所以希望你先再确证一下）
1.你说4度放过夜，该酶都会变成truncated，这个和你开始express出来recombinant的
protease有两者混合的现象结合起来看，很难让我相信这个酶会有autocleavage的活性
因为要知道，ecoli表达重组蛋白，其细胞中的protease浓度是很高的。如果真的具有
自剪切活性，你根本不可能拿到full-length的protease,expression的时候就自己切光
了。因... 阅读全帖 |
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w*******2
发帖数: 6 | 34 我有过一个类似的经历，重组表达cathepsin L-like cysteine protease会发生intact
变为truncated。 |
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E*********s
发帖数: 93 | 35 Doing western is a very good suggestion. I didn't do the western yet. Maybe you can try that first and tell me
know. It is reported in some cancer cells, P300 C-terminus is truncated. Don
't if that is the case for different normal tissues. |
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t******y
发帖数: 716 | 36 HeLa cell expressing a truncated ER protein. |
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t******y
发帖数: 716 | 37 红色的就是那个truncated ER 蛋白，用抗体识别。 |
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k***r
发帖数: 100 | 38 I agree with Ankyrin, looks like endosomes and lysosomes (try EEA1 and some
lysozyme markers). Some times, truncated protein after translation it
misfolds and directly sent to lysosome for degradation. |
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r***e
发帖数: 2539 | 39 难道是你做的KO，其蛋白（truncated）还有部分活性？
这个真是杯具。 |
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p******i
发帖数: 1092 | 40 PAT PAT
是不是因为你和其他2个LAB KO掉的GENE部位不一样？
因为mouse gene一般都很长啊，搞不好有什么alternative Transcription start site
或者alternative start codon啥的。没把这些alternative的敲干净，KO里面表达个
truncated也能凑活着用，就看不见表型了……
其实，就算全敲掉了，也不一定放心：万一有个啥miRNA正好也被敲掉了然后影响到其
他一坨GENE……
说到底，还是生物太复杂了…… |
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n******7
发帖数: 12463 | 41 情况大概是这样：我们做了很多cDNA clone，测序之后选取了一些进行了下游的实验，
主要是in vitro 的protein实验。我们鉴定了很多新的splicing isoform，其中有不少
有premature stop codon(可以是splicing 造成的，也可以使indel造成的）
现在我们想做一些quality control，去掉一些不靠谱的transcripts，于是出现了分歧
组里的大姐想法是要尽量跟已知的protein一致。把每条isoform对应的protein align
到已有的protein sequence上。如果整条protein基本align上去，即便使truncated
protein, 不管什么原因，都可以作为partial protein 保留。但是如果shifted frame
的amino acid sequence长到一定程度，那就认为这些protein sequence跟已有的
sequence太不一样，要除去
我完全明白大姐为什么那么想，因为我们实际test的是一些protein sequences
但是就我这部分工作，我需要关... 阅读全帖 |
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c********r
发帖数: 189 | 42
It's not truncated because it was detected in the input |
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g*********5
发帖数: 2533 | 43 1.大量磷酸化motif..
你先比较下同源蛋白，做个clustalw
先研究保守的。
2.L truncate form，看那一段和E结合。磷酸化位点应该在结合的那段上
pulse chase (fluore or isotope)， fluore如何做？谢谢。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 44 mitchondira proteins usually be cut a leader sequence when the protein
transfer into mitochondria.
the final truncated proteins would be thought as mature form.
and I add flag tag to the gene 3 prime, western showed most parts are mature
form. |
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a******8
发帖数: 56 | 45 In many cases, the NeoR cassette inserts into intron region without concern.
Why people do not think the NeoR poly A would cause truncated form of the
endogenous gene? If you still feel uncomfortable with this, why not try
transfecting into 293 cells and test the expression (using fluorescence, RT-
PCR for 3'UTR or others)? Good luck. |
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e**e
发帖数: 166 | 46 Targeted inactivation of transcription factors by overexpression of their
truncated forms in plants
Plant J 7: 162–172
Pil Joon Seo, Shin-Young Hong, Jae Yong Ryu, Eun-Young Jeong, Sang-Gyu Kim,
Ian T. Baldwin and Chung-Mo Park
please send to z******[email protected]
thanks a lot |
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l******n
发帖数: 298 | 47 一个基因的dual luciferase assay, 刺激以后有10倍的激活，非常兴奋。从-2000一直
都砍到-100了，还是10倍的激活，一点也没减少，这是什么原因呢？
还有就是renilla-cmv好像也能被调控，有这么一说吗？
望高手指点 |
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S*********s
发帖数: 304 | 48 可能性太多。
有一种可能性就是刺激了general transcription.
另外，luciferase assay本身就是不是太靠谱，最好有其他assay来confirm. |
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z********i
发帖数: 610 | 49 Thanks very much for your reply.
Although more info regarding your experiments is needed, but basically,
1. it is possible that WT hes1 activated promoter but dnHes1 (dominant
negative?) did not; it only suggests that the endogenous Hes1 in the cell
line you tested was not invoved in maintaining the basal activity of that
promoter. Actually, it is not a bad observation; it suggests that hes1
activated this promoter via DNA binding, becaseu usually dnHes should have
no or little DNA binding activ... 阅读全帖 |
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r*******y
发帖数: 48 | 50 1. 我没有做的很细致，但是我看到了dnHes1能antagonize WT Hes1 induced promoter
activity.
That is good;
2. 保守的序列我已经做了突变，但是仍然能看到WT Hes1的激活作用，因为有好几个
potential Hes1 binding sites，所以我不能排除其它的位点不起作用。我现在在做
truncation mutation，想找到Hes1 responsive element。
how long of this promoter you tested? mutation of that conserved binding
site resulted in how much percentage of reduction in its activation compared
with that of the WT promoter by Hes1? in most cases,it w ill not be only
one site that contributes 100% to that activation... 阅读全帖 |
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