E*C
发帖数: 1629 | 1 最近看的文章，已经敲掉的蛋白质 ，肿瘤种植之后，又表达了
咋回事涅 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 可以有很多种情况啊。
比方说他们敲的时候只是敲掉了第一个exon,但是其他exon东剪切西剪切之后
在某个条件下又剪出一个有活性的truncate了
【在 E*C 的大作中提到】
: 最近看的文章，已经敲掉的蛋白质 ，肿瘤种植之后，又表达了
: 咋回事涅
|
o**4
发帖数: 35028 | 3 我晕
【在 s******y 的大作中提到】
: 可以有很多种情况啊。
: 比方说他们敲的时候只是敲掉了第一个exon,但是其他exon东剪切西剪切之后
: 在某个条件下又剪出一个有活性的truncate了
|
s******y
发帖数: 28562 | 4 别晕。这种情况不少见。因为很多alternative splicing 并不需要第一个exon
【在 o**4 的大作中提到】
: 我晕
|
o**4
发帖数: 35028 | 5 一般ko，都会把最重要的exon给敲掉吧
【在 s******y 的大作中提到】
: 别晕。这种情况不少见。因为很多alternative splicing 并不需要第一个exon
|
s******y
发帖数: 28562 | 6 可是有时候我们的知识并不是那么完善，敲的时候根据理论以为是最重要的
exon并不一定就真的是细胞里最重要的exon, 甚至有些隐藏的exon很多人
并不一定就知道。
所以敲完之后，必须要用northern blot and polyclonal ab WB 做验证，就是这个原因
【在 o**4 的大作中提到】
: 一般ko，都会把最重要的exon给敲掉吧
|
o**4
发帖数: 35028 | 7 体内确实太复杂了，人算不如天算；
southern blot验证有啥用？基因组没问题了，蛋白质有可能还是会被western检测到吧
原因
【在 s******y 的大作中提到】
: 可是有时候我们的知识并不是那么完善，敲的时候根据理论以为是最重要的
: exon并不一定就真的是细胞里最重要的exon, 甚至有些隐藏的exon很多人
: 并不一定就知道。
: 所以敲完之后，必须要用northern blot and polyclonal ab WB 做验证，就是这个原因
|
s******y
发帖数: 28562 | 8 常规验证，双保险，万一出了问题，也可以定点排除看看到底是那一环出了问题
【在 o**4 的大作中提到】
: 体内确实太复杂了，人算不如天算；
: southern blot验证有啥用？基因组没问题了，蛋白质有可能还是会被western检测到吧
:
: 原因
|
o**4
发帖数: 35028 | 9 southern只是验证genome，不能保证剪切的问题吧，呵呵
【在 s******y 的大作中提到】
: 常规验证，双保险，万一出了问题，也可以定点排除看看到底是那一环出了问题
|
s******y
发帖数: 28562 | 10 设计得好的也可以啊，比方说如果是切5-end exon, 那就用3-end的探针来杂交，
看看转录出来的片断有多长。如果出来一条不是在意料之中的长度的话，
那就说明可能出来了意外的剪切
【在 o**4 的大作中提到】
: southern只是验证genome，不能保证剪切的问题吧，呵呵
|
|
|
p******d
发帖数: 3737 | 11 也有可能是少部分细胞ko效率不好，成为优势群，形成肿瘤。或者promoter失活也是可
能的。 |
o**4
发帖数: 35028 | 12 你说的是nothern？
【在 s******y 的大作中提到】
: 设计得好的也可以啊，比方说如果是切5-end exon, 那就用3-end的探针来杂交，
: 看看转录出来的片断有多长。如果出来一条不是在意料之中的长度的话，
: 那就说明可能出来了意外的剪切
|
a********k
发帖数: 2273 | 13 能问一下为啥要用southern而不用PCR么？就是平时做genotyping用的，为啥southern
这样麻烦的东西用得很多呢？
原因
【在 s******y 的大作中提到】
: 可是有时候我们的知识并不是那么完善，敲的时候根据理论以为是最重要的
: exon并不一定就真的是细胞里最重要的exon, 甚至有些隐藏的exon很多人
: 并不一定就知道。
: 所以敲完之后，必须要用northern blot and polyclonal ab WB 做验证，就是这个原因
|
s******y
发帖数: 28562 | 14 Yeah! Sorry my mistake!
【在 o**4 的大作中提到】
: 你说的是nothern？
|
p*****m
发帖数: 7030 | 15 我猜她说的是northern，这样才谈得上看什么3'转录的问题 对于KO来说看看northern
，或者对于转基因来说看看southern，而不光是PCR 主要还是考虑到KO可能会在recombination的时候发生了怪异的重组 甚至把切出来的片段插到别处去了 这一步因为有个open end在那里飘着 可能会发生没法预测的事情。transgene也一样，transgene还存在个copy number问题
southern
【在 a********k 的大作中提到】
: 能问一下为啥要用southern而不用PCR么？就是平时做genotyping用的，为啥southern
: 这样麻烦的东西用得很多呢？
:
: 原因
|
s******y
发帖数: 28562 | 16 Northern blot, Northern blot. Sorry my mistake :)
The good thing of northern is that you can directly see the real size of the
mRNA, which is not very doable with PCR
southern
【在 a********k 的大作中提到】
: 能问一下为啥要用southern而不用PCR么？就是平时做genotyping用的，为啥southern
: 这样麻烦的东西用得很多呢？
:
: 原因
|
c******r
发帖数: 3778 | 17 有几种情况：
1. 上面sunny同学说的很对。有alternative splicing等其他可能。
2. ko一般都是ko一两个exons，一般assume不完整的RNA或者peptide不稳定，会很快被
代谢掉。但是事实上经常不是这样。有很多蛋白即使ko掉几个exons后还有detectable
的peptide，虽然size shift了，但是确实western可以detect。
3. 如果是conditional ko就有ko效率，和部位，细胞种类等其他原因导致在一定程度
上可以detectable。
不论怎样，要证明ko都要从几个方面来证明：
1. 从genomic上，要跑southern，看到size减小as expected。
2. 从RNA上，northern，和western证明没有detectable的stable的蛋白。如果有，要
证明这个蛋白的功能被comprise了。
3. 从功能上证明这个蛋白的功能没有了。
4. 从phenotype上证明这个功能和这个phenotype直接的联系。 |
H****N
发帖数: 997 | |
f*******e
发帖数: 354 | 19 KO 有很多种：Conventioanl KO，可能会出现truncate
conditional 一旦cre表达不全或不过 确实可能KO不全
inducible的那就更有可能了
移植的肿瘤后有表达？
是移植了KO的肿瘤还是一直到KO的小鼠，这样两种细胞有一种不是KO就嘛事就有可能了
啊？
【在 E*C 的大作中提到】
: 最近看的文章，已经敲掉的蛋白质 ，肿瘤种植之后，又表达了
: 咋回事涅
|
