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a******a
发帖数: 283 | 2 Here is a technology question. I know it should be possible to improve the
result and would like to hear some more suggestions.
Basically we are trying to push the limit of detection to the level of 10e4
or even 10e3, for viral RNA isolated from animal blood samples, for
pharmacokinetic study.
Our samples contain mostly carrier RNA with viral RNA of interest.
And with SBYR or TaqMan, we can stably detect 200-300 copies per well (of 96
-well setting), that translates into 10e5 copies/ml with our ... 阅读全帖 |
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h********n
发帖数: 4079 | 3 有没有谁发现哪个taqman probe做realtime PCR的时候有off target amplify? |
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l********n
发帖数: 260 | 4 我最近开始microRNA相关课题, 很想了解些Taqman real time PCR引物设计, 定量分析
流程什么的; 请大家帮我提供点资料 |
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g******r
发帖数: 139 | 5 请大牛指教，是不是SYBR作real-time PCR比Taqman assay稳定性差很多？
最近有些实验，用SYBR的时候replicate well之间的variation很大，从0.5到2个cycle
不等, 导致error bar很大，很难看，即使用了four replicates也不是很理想。有时试
验组比对照组的值少了50%，也不知道是不是真的。Ct值越小的gene，误差就越小，超
过25cycles的gene就很容易出现跳跃。
上样时我极度小心，没有气泡。我看过我的plate，well之间的体积相差极小，不可能
超过5%的误差。adhesive cover密封的应该也没有问题。
应该也不是plate的问题，同一批次的plate用作taqman assay时就非常完美，error
bar 极小，所以操作上应该也不是问题。都用得是ABI7500 fast.
当然，我不是用taqman assay来重复SYBR的试验，不是完全一样的比较。只是有一种感
觉，SYBR的chemistry的稳定性不好，导致well之间跳跃性很大。而taqman assay 就没
有这个问题。
不知... 阅读全帖 |
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B******o
发帖数: 496 | 6 Sunny, 你的说法不正确。Sybr和Taqman在sensitivity上是一样的, Sybr green与
double strand DNA结合，而taqman依靠PCR酶酶切活性来使原本quench的fluorescent
dye发光。 ABI常宣称说Taqman更specific，因为需要probe和target sequence结合才
会被PCR酶切到。实际上，这个hybridization的过程也有non-specific binding的，它
并没有提高PCR本身的sensitivity，而只是免去了看melting curve的必要. Sybr
Green的方法结合melting curve在sensitivity上和taqman一样。
我临时查了一下就发现了很多文章表达了同样的看法，http://mic.sgmjournals.org.proxy1.athensams.net/content/149/1/269.short
很多人的bias仅仅是公司特意宣传下被欺骗了而已。
前面ArtyArty说的很中肯，楼主连自己primer的线性扩增好不好都没测过，显然在很多... 阅读全帖 |
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a******a
发帖数: 283 | 7 我的体会是SYBR的背景比taqman要大。是不是更加sensitive这个很难说，但是如果背
景很大的话，就容易出现无法读取低信号的问题。
taqman相对来说干净很多。我常用的对照样品，不是每次，但是基本上也是plate-to-
plate的差异很小，在0.3到0.8之间。
个人偏爱Taqman，觉得SYBR麻烦很多。尤其是最近出现的一系列问题，对SYBR失去耐心
了。 |
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g******r
发帖数: 139 | 8 板子用的同一批次，应该是干净的。至于检验机器，这个是很可能。每次用这个
ABI7500 fast的时候都说什么calibration expried, do you want to continue (
something like this)。
但是相同时间下Taqman assay没有问题。是不是这个机器校正过期对SYBR的影响特别大
，但对Taqman assay没有什么影响呢？
但是确实这个可能是原因，也许需要做SYBR的校正，而taqman assay用其它的filter,
可能还不受影响。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 9 Taqman 因为信号取决于probe, 所以对杂带的容忍程度高一些，所以Ct可以做到稍微高
一点点（也就一点点而已）。你的这个问题其实主要是因为不同公司作的buffer的优化
程度不一样。
如果你用同一个buffer，primer, 以及同一个酶来跑，你就会发现其实这两者相差真的
没那么大。
对于SYBR,一般说可以做到是30, 但是出于谨慎，凡是超过25的我都会直接扔掉然后重
新配更
浓的样品从新作。另外，一般地方会让你加个1ul cDNA sample,我是宁可把cDNA
sample 稀释了然后直接加个3ul（因为这样上样的误差小很多）。
你的情况，我的建议是不要浪费时间搞什么优化，直接用Taqman吧。
如果你真的有特殊原因要用SYBR，那么建议你直接搬用Taqman buffer（不加probe即可
），然后自己手工加SYBR-green and DMSO, 而不是从头优化Invitrogen buffer.
Ct |
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l***y
发帖数: 638 | 10 理论上讲Taqman的特异性要高过sybr green，因为它只有在probe结合在PCR扩增的区间
才会有信号，PCR的non-specific amplification或者probe的non-specific binding两
者之一的情况都不会产生信号，而sybr green只要有非特异PCR扩增就会出信号
另外Taqman可以做internal control，一个孔同时测未知基因和housekeeping，可以降
低部分variation。
Taqman就是太贵了，一般做做实验sybr green也就差不多了，反正qPCR也就是一个data
，真要做solid肯定得有其他independent的方法验证。
fluorescent |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 这个我不太同意。
首先，这两者的理论sensitivity的确差不多，而且在某种程度上来说，Sybr green因
为信号强度大，其实在检测上更容易被仪器看到。不过，你要是真的两者都做一次你就
知道了，对于含量特别低的样品，Sybr green的信号强度根本没有什么用，因为不同重
复孔跑出来的差别太大了（类似楼主看到的这个问题），导致那些跑出来的常常都是废
数据，所以真实的有效敏感度没有那么高。
另外，你可能对Taqman 的特异性的理解有些偏差。那个fluorescent probe, 要产生荧
光必须有两个条件：1，必须在template 上有PCR reaction 在进行； 2。probe 必须
能够结合在template 上面。必须两个条件同时满足，缺一不可，如果仅仅是probe非特
异结合是没有荧光的。
但是对于Sybr-green, 只要满足第一个条件就可以有信号了。
这样一来，Taqman qPCR 和Sybr-green 的特异性向比较就类似于Nested PCR 和普通
PCR的差别，前者在理论上肯定比后者更特异。
另外，Sybr-green 对于高Ct 的样品，光... 阅读全帖 |
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g******r
发帖数: 139 | 12 谢谢你的建议。我知道qPCR的efficiency, 但确实没有测过各个primer的efficiency到
底怎么样。但理论上effiency对Absolute Quantification影响很大，而对ddCT方法的
影响有限。而我就只用ddCT方法比较各个gene在不同条件下的表达，没有去比较基因间
的表达。至于ddCt的方法有人要argue有缺陷，不理想，那是另外的话题 (体外话，我
发现没有测primer效率的人不在少数，当然绝大部分人也是用ddCt)。
以一个简单的knockdown为例，设目标gene表达量为X0，在Ct时的PCR产物为Xt0，效率
为EX, reference gene的表达量为R0，在Ct时的PCR产物为Rt0，效率为ER；在
knockdown情况下目标gene表达量为X1，在Ct时的PCR产物为Xt1, reference gene的表
达量不变，仍然是R0，在Ct时的PCR产物为Rt1 (两次的Ct可能一样，也可能不一样)。
Xt0=X0 (1+EX)CtX0, Rt0= R0 (1+ER)CtR0 ;Xt1=X1 (1+EX)CtX1, Rt1... 阅读全帖 |
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T****i
发帖数: 15191 | 13 尼玛，器人反应了国内人的普遍无知倒是真的。
高端医疗设备，中国还要从欧美进口。什么叫欧美没有基本医疗设备制造能力？
测试剂？你指试剂盒？现在给武肺用的就是Taqman assay (一种real time PCR)，PCR
仪有德国产的有美国产的，你放到中国产，精度能否保证都是问题。精密点的加样枪，
尤其是multi-chanel的，法国德国产，中国产的没法用。耗材，中国产的Eppendorf 管
，pipettte tip，PCR plate都不能保证质量。试剂，就更别说了。即使到最近两年，
中国生物千老用的试剂，凡是要求质量高的，哪怕 培养细胞用的gelatin，还要用国外
的。Taqman assay 用的primer和probe，都是第一天定第二天到，你以为从中国发货。
口罩啥的只不过一时产能上不去。还不是因为全球化把这些低端的产业转移到中国了？
尼玛，真是无知无畏。 |
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c*********9
发帖数: 2 | 14 Archery Biotechnology (archerybio.com), a venture funded company, focuses on
developing and delivering most advanced molecular biology based cancer
diagnostic tests. The company is located in Nanjing High-Tech Development
Zone, and has been selected by and received generous support from the
renowned Nanjing "321" talent program.
Job Description and Responsibilities:
• Responsible for product development and delivering TaqMan PCR,
Microarray and NGS based diagnostic products
• D... 阅读全帖 |
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A*******e
发帖数: 284 | 15 很久不用taqman了 几乎忘了原理,你说你是在annealing后面收集荧光. 你用的机器我
没有用过,不清楚具体设置.你用的是两步法还是三步法. 尝试三步法在延伸后面收集荧
光.taqman好像依赖taq酶的外切酶活性对吧. |
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b******k
发帖数: 2321 | 16 一个分子生物学技术主管/经理的位置 有兴趣的同修可以直接联系他们负责人 下面是
中英文的job description
南京艾启瑞分子生物技术有限公司
南京艾启瑞分子生物技术有限公司是一家由海外归国科学家创办的，专注于开发和提供
当今最领先的肿瘤和遗传病分子生物学诊治技术。本公司位于南京高新技术开发区，去
年入选并得到著名的南京"321"人才计划的大力支持。
分子生物学技术主管/经理
学历和经验要求：
o 分子生物学、生物化学、细胞生物学，病理学专业硕士或博士学位
o 具有扎实的分子生物学理论基础。丰富的DNA、RNA和定量 PCR (TaqMan) 等有关分子
生物学技能 （3年以上经验）
o 较强的英语阅读和口语水平
o 具有一定的管理经历和经验
o 能熟练运用Office Word、Excel、Powerpoint和有关视图软件
职位描述：
o 上任后将在美国进行短暂的技术转让学习，回国后负责公司整个肿瘤分子检测技术流
程的技术转让，建立和运行
o 负责组织建立并实施质量体系
o 负责新产品的开发、创新与引进。开发以基因芯片和基因测序为平台的检测产品
o 制订并组织实施技术人员... 阅读全帖 |
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B******o
发帖数: 496 | 17 if your gene is very lowly expressed, big variations between replicates can
be possible. Otherwise, it is the way you handle the sample that causes the
problem.
Sybr Green assay is as sensitive as Taqman assay. I don't think ABI(life
tech)'s claim is true that Taqman is more sensitive.
cycle |
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s******y
发帖数: 28562 | 18 SYBR system 天生就比Taqman 的特异性差一些，在实践上，线性区间也差一些。但是
差别没有那么大。
你的问题主要应该是PCR condition 没有优化，检测的有效Ct区间不高。
注意你用的SYBR premix 和你的Taqman premix 不是同一个buffer, 不能直接比较优化
度。
大部分realtime PCR premix 的有效线形区间是12-25.对于高Ct sample误差变大的原
因主要是在那些区间的反应已经不再是线性，而是会受一些随机因素很大的影响。
我的建议是，加大你的样品的上量，尽量把有效Ct控制在30之内。如果你没有办法控制
上样量的话，那么就需要优化条件，去试探镁离子组合，dNTP含量，annealing
temperature, extension duration等等条件，把你的线性区间调到高Ct区。
cycle |
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l***s
发帖数: 841 | 19 SYBR Ct 35肯定就测不准了。一般不要超过33. 只要有RNA表达（哪怕很低），这个都
不应该是个问题。大多数读数都在30以下，很少超过32. Replicate之间误差一般在0.0
-0.2之间。 若Ct读数太高，大多情况下是primer设计的太糟糕，效率低下。每次我用
新primer之前，都要检验一下，确保效率，特异性都没问题。对于没用过的primers，
先跑QC，有问题的primer比例很低，只有10%左右需要重新设计。其实TaqMan对懒人来
说比较合适，因为primer，master mix什么的，条件都已经optimized,直接用就行了。
若经常做qPCR的，SYBR是即实惠又可靠的选择，完全没必要买那么贵的TaqMan assays。 |
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发帖数: 1 | 20 Methods Mol Biol. 2012;822:33-52. doi: 10.1007/978-1-61779-427-8_3.
Stem-loop RT-qPCR for microRNA expression profiling.
Hurley J1, Roberts D, Bond A, Keys D, Chen C.
Author information
Abstract
Quantification of the microRNAs (miRNAs) in cells or tissues is a crucial
step in understanding their biological functions. Development of the stem-
loop reverse transcription procedure and TaqMan(®) miRNA assays enables
accurate detection of miRNA expression levels by quantitative PCR.
Increased ex... 阅读全帖 |
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v*******n
发帖数: 8995 | 21 老板要哥每个实验点取五个样
每个药剂取五个浓度 用的还是taqman
玛丽隔壁 如果完美的话
麻痹要十个96孔版
一次实验基本500刀
哥一想 麻痹 做两个再填三个数得了
n=5 又快又好又准确
既有实验误差 又有统计误差
哥两篇cell子刊 没空和你丫耍猴
哦yeah
★ 发自iPhone App: ChinaWeb 1.1.5
★ 发自iPhone App: ChinaWeb 1.1.5 |
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v*******n
发帖数: 8995 | 22 这个
是molecualr beacon
或者taqman
正反是用来pcr
最后的那段是反向的探针在目标rna上
3‘的把5’的荧光抑制 不发光
等pcr开始了 到了那段把丫分解 或打算就尼玛发光了
这个比较准确 假阳性不多
★ 发自iPhone App: ChinaWeb 1.1.5 |
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v*******n
发帖数: 8995 | 23 这个
是molecualr beacon
或者taqman
正反是用来pcr
最后的那段是反向的探针在目标rna上
3‘的把5’的荧光抑制 不发光
等pcr开始了 到了那段把丫分解 或打算就尼玛发光了
这个比较准确 假阳性不多
★ 发自iPhone App: ChinaWeb 1.1.5 |
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a***k
发帖数: 1038 | 24 你说的原理我这个外行看下维基早就明白了。我闹不懂的是金银潭医院的用的引物找不
到对应的序列。
至于选择性，不是说新病毒和舟山的蝙蝠的病毒相似99以上，难道随便切的一个片段不
可以和新病毒一样吗？
: 这个
: 是molecualr beacon
: 或者taqman
: 正反是用来pcr
: 最后的那段是反向的探针在目标rna上
: 3‘的把5’的荧光抑制 不发光
: 等pcr开始了 到了那段把丫分解 或打算就尼玛发光了
: 这个比较准确 假阳性不多
: ★ 发自iPhone App: ChinaWeb 1.1.5
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C*I
发帖数: 4736 | 25 一直在误导，现在还在误导。 说说明corona virus 不可以从蝙蝠直接传染给人，必须
经过一个中间宿体性的其它动物才能传染给人。所以，病毒发生后，就故意误导全国人
民去海鲜市场找证据，找其它野生动物的麻烦。 而且还是病毒所去找的，找完了还装
模做样化验呀，分离呀什么的。最后把责任全部推给了海鲜市场的动物。可是那种动物
，一直不敢说，说了其它相关已经在人就会去早那种动物监测。 所以压根不说，打马
虎眼。
事实上，早在2013 年，就是这个武汉病毒研究所，已经从来自云南的蝙蝠身上所携带
的corona virus中分离出第一株蝙蝠SARS类似样的冠状病毒的活病毒，其中就包含了类
似于S类型的基因。从而证实这株病毒能够使其接受和SARS病毒相同的受体，并能够感
染人的细胞。对此新发现，武汉病毒所还把它以武汉病毒研究所的英文简称命名“WIV1
”，以彰显这一发现的重要价值和属于自己第一个发现的巨大研究成果。这个成果刊载
于2013年11月的《自然》杂志。
就是说，从云南弄回来的这种蝙蝠所携带的类似于sars的 corona virus， 可以不经过
其它受体/宿体，而直接传染给人。 他们... 阅读全帖 |
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C*I
发帖数: 4736 | 26 一直在误导，现在还在误导。 说说明corona virus 不可以从蝙蝠直接传染给人，必须
经过一个中间宿体性的其它动物才能传染给人。所以，病毒发生后，就故意误导全国人
民去海鲜市场找证据，找其它野生动物的麻烦。 而且还是病毒所去找的，找完了还装
模做样化验呀，分离呀什么的。最后把责任全部推给了海鲜市场的动物。可是那种动物
，一直不敢说，说了其它相关已经在人就会去早那种动物监测。 所以压根不说，打马
虎眼。
事实上，早在2013 年，就是这个武汉病毒研究所，已经从来自云南的蝙蝠身上所携带
的corona virus中分离出第一株蝙蝠SARS类似样的冠状病毒的活病毒，其中就包含了类
似于S类型的基因。从而证实这株病毒能够使其接受和SARS病毒相同的受体，并能够感
染人的细胞。对此新发现，武汉病毒所还把它以武汉病毒研究所的英文简称命名“WIV1
”，以彰显这一发现的重要价值和属于自己第一个发现的巨大研究成果。这个成果刊载
于2013年11月的《自然》杂志。
就是说，从云南弄回来的这种蝙蝠所携带的类似于sars的 corona virus， 可以不经过
其它受体/宿体，而直接传染给人。 他们... 阅读全帖 |
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C*I
发帖数: 4736 | 27 Published: 30 October 2013
Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the
ACE2 receptor
Xing-Yi Ge, Jia-Lu Li, Xing-Lou Yang, Aleksei A. Chmura, Guangjian Zhu,
Jonathan H. Epstein, Jonna K. Mazet, Ben Hu, Wei Zhang, Cheng Peng, Yu-Ji
Zhang, Chu-Ming Luo, Bing Tan, Ning Wang, Yan Zhu, Gary Crameri, Shu-Yi
Zhang, Lin-Fa Wang, Peter Daszak & Zheng-Li Shi
Nature volume 503, pages535–538(2013)Cite this article
Abstract
The 2002–3 pandemic caused by severe acute respirator... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 28 非洲猪瘟病毒微滴数字PCR (ddPCR)方法的建立及应用
邬旭龙1Δ, 肖璐2Δ, 宋勇5, 林华4, 陈世界4, 杨苗4, 安微4, 姚学萍1,3, 杨泽晓1,
3, 王印1,3
摘要：【目的】 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)能导致猪群高死亡
率，从而造成严重的经济损失。因此，建立严密、高效的防控系统，包括灵敏、准确的
诊断方法以及高效的预报预警机制等，以避免ASF传入我国。本文旨在建立一种新型而
高灵敏度的ASFV微滴数字PCR (Droplet digital PCR，ddPCR)检测方法。【方法】 针
对ASFV K205R基因设计一对特异性引物和TaqMan探针，通过反应条件优化，建立了ASFV
实时荧光定量PCR (qPCR)和ddPCR检测方法；并对两种方法的线性关系、灵敏性、特异
性和重复性进行了评估，利用建立的ASFV检测方法对163份国内和进境的组织样本及血
清样本进行检测，血清样本经商品化ASFV ELISA试剂盒复检，评估不同方法检测结果的
符合率。【结果】 建立的ASFV qPCR和ddPCR检测方法线性... 阅读全帖 |
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T****i
发帖数: 15191 | 29 它们的RT-PCR是Taqman 还是普通的Sybr Green? |
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T****i
发帖数: 15191 | 30 看来是Taqman，但没有看到列primer 和probe序列。难道序列还保密？ |
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发帖数: 1 | 31 taqman也得需要引物，而且比sybr green 还要多一个探针序列 |
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h****u
发帖数: 618 | 32 需要买一台PCR 做 mRNA 和 microRNA expression. 以前一直都用 Applied biosystem
StepOnePlus™ PCR, 但是最近看到 Bio-Rad CFX96™ 不需要calibration
,但是StepOnePlus™ 是需要买calibration kit的。不知道哪个更好用呢？如果
两者性能相当，买 biorad 就一劳永逸了。
而且听sales 说， biorad 使用5个led 激发， steponeplus 只有一个蓝色led， 所以
做Multiplexing的话，是不是biorad 更好呢？ 而且应为多个LED，light path 也和
StepOnePlus™ PCR 不同，所以不用ROX 校准。真是这样吗？
另外在 biorad 上使用 taqman 的试剂会不会有问题呢？ 我看到Applied Biosystem
网站上有专门给BioRad CFX96™ 设计的试剂。
请大家指教。非常感谢！ |
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n*****n
发帖数: 202 | 33 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: niligun (泥里滚), 信区: Biology
标 题: 有temp工作，有意者站内联系
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Mar 1 19:57:03 2012, 美东)
Pharmaceutical company in North NJ. Temp position available. prefer
candidates with experience in cell based assays, molecular cloning, taqman
assay,DNA/RNA isolation.
H1b visa can be sponsored.
If you are interested, please email me.
Thanks. |
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l******u
发帖数: 936 | 34 I could do it.
by TaqMan Low Density Array, |
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h********n
发帖数: 4079 | 36 我通常用qiagen的kit提total RNA, 然后rt-pcr通常不是很大的问题, 用taqman |
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l******u
发帖数: 936 | 37 我说的就是一种array， 基于 TaqMan 的微流芯片。而且出来结果是定量的， 不用
technical validation。 |
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X***n
发帖数: 366 | 38 TaqMan array from ABI.
95 degree heat to lysis the cell to release the total RNA.
Pool of stem loop reverse primer to do reverse transcription. RNasin to
inhibit microRNA degradation. |
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w*******g
发帖数: 16 | 39 用shRNA来knock down一个基因。用相同数目的细胞做western blot后，能明显的看到
shRNA降低了蛋白的表达量，同样的细胞用来做taqman realtime pcr却看不到处理组和
对照组的区别。pcr产物跑电泳检测确实pcr产物都是单一条带。挺困惑的，请各位大牛支招啊
，多谢 |
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a***e
发帖数: 1010 | 40 haven't used taqman-qPRC myself.
LNA probe is still p32 labeling, haven't tried that myself either. |
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A******y
发帖数: 2041 | 41 If you use taqman, it is unlikely you can use the sybr green primer. There
are RT-PCR primer library these days, just use sybr-green and use the primer
from the library. Also, you need to use multiple house keeping genes these
days. |
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n*****r
发帖数: 78 | 42 质量哪个相对好一点？我以前一直在operon买，MWG Biotech, Operon
Biotechnologies, and Medigenomix合并后，引物质量下降不少。 我一直在做Taqman
qPCR, 最近在operon买的probe有点问题。ABI的又太贵，大家有什么推荐？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 43 IDT, the best I used so far
Taqman |
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C*******e
发帖数: 4348 | 44 IDT
不喜欢operon的
虽然他们给个盒子还不错
Taqman |
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a*****g
发帖数: 543 | 45 operon太慢。
IDTservice很快。 网站上的几个软件还可以。
ABI的价格还可以忍受，就是deliver太慢
Taqman |
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f**d
发帖数: 1952 | 46 是q-PCR (SYBR Green)好还是Southern好?
如果是q-PCR的话,有没有用TaqMan的可能性? |
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R****n
发帖数: 708 | 47 多少个？几十还是几百？
几十的话，HRM, taqman.如果是genomic DNA可以考虑一下MPLA (multiplex probe
ligation amplification)在sequencer上作，一根管子能做三四十个位点
几百的话，single base extension, Ligation or Hybridization microarray. 公司
应该会帮你设计probe的. |
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a*******g
发帖数: 162 | 48 想GENERATE HOMOZYGOTE的TG MICE， 请问怎么可以GENOTYPING啊，用QPCR可靠吗？需
要用TAQMAN还是普通QPCR就可以了？多谢！ |
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R****n
发帖数: 708 | 50 syber green原理是用allele specific PCR吧，一个primer 3'端用来区分phenotype.
我没做过不太清楚效果。还有什么和ligation结合的，HRM的。你说的太笼统了。
Taqman是用probe,两边一个dye一个quencher，不同的sequence dye不一样，一管PCR搞
定。这个基本上是业界的标准方法 |
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