a***e
发帖数: 1010 | 1 if the 5'-end of your ssRNA is -OH, you can add a Pi by T4 PNK.
although your substrate is gamma-Pi from ATP, the product is alpha-Pi. |
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L****S
发帖数: 89 | 2 Thanks for the discussion. I know which papers you are talking about. We
have to think about immunology here.
In the endosomal compartment, for dsRNA, ssRNA, DNA, TLR3/7/9 sense them
accordingly. No big question here.
In the cytosol, dsRNA is a strong "danger" signal showing viral infection
. That's why every cell has PKR, RIG-I/MDA-5, etc. So I speculate, when
liposome delivers ssRNA, RIG-I/MDA-5-mediated cytosolic response dominates
the TLR3 signal, quantitatively or qualitatively.
In the pape... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 3 我来说说ngAgo的局限：
1.ngAGO是否真如文章所述，不和ssRNA结合。我觉得需要通过通过高通量测序进行验证
，电泳胶的灵敏度太低，看不到不代表没有。
2.ngAgo是否和内源ssDNA或ssRNA结合，如果它的结构和TtAgo类似（包含PIWI，PDZ以
及MID domain），那么这些保守的domain也存在于与ngAgo同源的argonautes（Ago2）
中，需要利用灵敏度比较高的手段才能说明这个问题，保不齐ngAgo会对PIWI或RNAi通
路有影响，5‘p-ssDNA以及5’p-ssRNA在细胞中存在，尤其是在germ cell的分化过程
中以及很多种类的癌细胞中，如果ngAgo和它们结合的话，这将大大限制其在此类细胞
中的应用。
3. ssDNA loading 的问题，目前对于ssDNA load到Argonaute形成DNP的机制尚不清楚
，在细胞内ssDNA load到Argonaute是不是需要其他蛋白质（比如伴侣蛋白，热激蛋白
等）的辅助，甚至Argonaute折叠成functional protein是否需要ssDNA的帮助，这些都
不是很清楚。
... 阅读全帖 |
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j******i
发帖数: 939 | 4 lentiviral paticles(LP) 就是光壳子 没有病毒ssRNA包装到里边 lentiviral vector
(LV)就是一般的病毒载体包含ssRNA信息。 |
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T*****e
发帖数: 247 | 5 http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature1
标题 DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute
摘要
RNA interference is widely distributed in eukaryotes and has a variety of
functions, including antiviral defence and gene regulation1, 2. All RNA
interference pathways use small single-stranded RNA (ssRNA) molecules that
guide proteins of the Argonaute (Ago) family to complementary ssRNA targets:
RNA-guided RNA interference1, 2. The role of prokaryotic Ago variants has
r... 阅读全帖 |
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w***o
发帖数: 151 | 6 We can add a 5'-PO4-DNA (Single Stranded) to the 3'-end of a ssRNA using T4
RNA ligase I, but cannot add a 5'-PO4-RNA (single Stranded) to 3'-end of
ssDNA.
Highly appreciated any suggestion on how to add a ssRNA to a ssDNA. Thanks a
lot |
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s*********t
发帖数: 16647 | 7 ☆─────────────────────────────────────☆
ssRNA (offeroffer) 于 (Sat Nov 5 00:24:33 2011, 美东) 提到:
在redmond. 现在2个阿姨（一个讲中文，一个讲英文），6，7个小朋友。阿姨有丰富的
幼教经验，对小朋友有爱心，有耐心。小朋友每天的活动很丰富，唱歌，跳舞，画画，
写字，读书，做手工，户外活动。我们家1岁多的娃每天回家都有画的画，或者写的字
，或者做的手工带回家（当然是老师帮忙完成的，但是小朋友很自豪）。我家小朋友只
在送去的第一天哭了，以后每天都开开心心的要去阿姨家。可见她们还是有经验对付小
朋友的。
这里是她们的网址：http://www.educationhilllearningcenter.com/。 如果有刚好需要这方面信息的朋友可以看看。
☆─────────────────────────────────────☆
benchmark (maine) 于 (Sat Nov 5 00:27:41 2011, 美东) 提到:
赫赫，不错。
支持
☆──────... 阅读全帖 |
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w******e
发帖数: 1187 | 8 thank you for your suggestion. I do have some sort of standard points
for my PCR (i.e., I can quantitate my PCR product reasonablly well).
However, if I don't have a way to accurately measure the amount of starting
RNA template, the whole thing wouldn't make sense.
right now, I use nanodrop to measure the template (which is short ssRNA),
and the standard points (which is short ssDNA). do you have any suggestion
on quantifying the amount more accurately? If I can nail these two,
the yield is easy |
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w******e
发帖数: 1187 | 9 多谢信息。我看了眼picogreen，可惜不能用在ssRNA上。最初的template定量
始终是个问题。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 10 which enzyme should I use to add NTP to 3' end?
can you recommend a protocol too?
thank you! |
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w******e
发帖数: 1187 | 11 thx, but my 5'end would be occupied by a biotin-GMP already, so
I need to use 3'end:( |
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a****k
发帖数: 1130 | 12 T4 RNA ligase with 32pCp? |
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a***e
发帖数: 1010 | 13 yeah, correct.
I struggle some time. it just doesn't jump out of my head. |
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w******e
发帖数: 1187 | 16 btw, did any of you guys try adding alpha ATP using E coli poly A
polymerase? I saw it in a paper once and already bought the stuff,
don't want to waste them...
thanks a lot! |
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m******5
发帖数: 1383 | 17 I am still wondering why it runs around the similar position as its DNA
template. RNA product is ssRNA while the DNA templete is dsDNA…………
ds |
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g*********d
发帖数: 233 | 18 RNA干扰及其在动物繁殖中的应用
2009-12-28
RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通
过 RNA 调控基因表达的机制, 它是指在真核细胞中引入双链 RNA分子从而导致具有序
列同源性的基因产生特异性基因沉默 (gene silencing)的现象 。由于 RNA干扰可以阻
断特定的基因表达, 具有超越疫苗和抗病毒药物的诸多优点, 因此在阐述基因功能以及
蛋白质相互作用等方面, 表现出诱人的前景。近年来随着分子生物学的发展, RNAi 的
机制也不断被阐明, 同时国内外研究也证实 RNAi 技术可以为动物繁殖过程中所涉及的
基因功能提供一条新的思路, 这在科研和生产实践上都具有重要的意义。
1 RNAi的发现
Matzke 等于 1989 年报道了启动子介导的序列同源性基因共转染烟草可引起转
基因表达发生沉默。 1990 年, Napoli 和 Van der Krol 等为了让矮牵牛花的颜色更
加鲜艳, 把与紫色相关的查尔酮(chalcone)基因转染到牵牛花内, 结果意外发现, 植物
体的颜色... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 19 没用过RACE kit
但是做过RACE
你要3'不？
基因多长？
我用的RLM-RACE，就是RNA ligase mediated RACE
你搜文献应该能搜到
具体就是利用RNA ligase可以连ssRNA+ssDNA
合成DNA oligomer，上面有一段adaptor sequence（跟你的目的基因/目的基因组没有
同源性就行），5’端和3’端都要-OH吧，然后RNA ligase会催化把这段DNA连到mRNA上
，再做1st strand cDNA synthesis
然后用gene specific reverse primer和adaptor forward primer (可以是你前面用的
adaptor，也可以重新设计引物，往里面来一点，做巢式PCR）来扩你要的基因
这样子好像应该比$740便宜很多 |
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g******l
发帖数: 38 | 20 最近做了一个 -ssRNA病毒的nucleoprotein，EMSA的结果发现它和人工合成的一段RNA
没有binding，请问这个结果正常么？
关于病毒nucleoprotein，有好的review或书籍么？
不胜感激! |
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f******s
发帖数: 115 | 21 牵强么？我一个reviewer就是揪着这点 别的都没啥实质性意见
我在想能不能通过解释不同细菌组分可能释放的时间不一样，比如lps肯定先释放并且
接触细胞，这样tlr4可以再第一天开始就被化合物抑制；最后可能才是细菌single
stand RNA,这样能解释为什么识别ssRNA的tlr8为什么会在第7天被化合物抑制 这样激
活受体的时间也不一样
say
for |
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o*******a
发帖数: 242 | 22 乙肝病毒感染后，大部分会自愈，因为人体产生有效抗体。所以很多人自己感染后都不
知道。但是有10-20%的人不会产生有效抗体，会转成慢性病毒携带者（慢性乙肝）。
病毒携带者在pregnancy时会感染胎儿，因为胎儿和小婴儿的免疫系统（T细胞）没有发
育完全，不能产生有效抗体。所以，在胎儿和婴儿时感染大多数都会转成慢性肝炎，成
为病毒携带者。
病毒在肝细胞复制时会杀死肝细胞，但肝细胞能自我复制，死了的肝细胞会由其他分裂
代替。但是如果正常肝的结组织构被破坏了，复制的肝细胞不是一个一个排列在基底膜
上，而是乱长在一起，就会导致肝硬化。如果病毒太仓狂，大部分的细胞都死了，就会
产生爆发型肝炎，死亡率高达60-70%。慢性乙肝炎会产生癌变，导致肝癌。因为
heptatitis B virus 复制是dsDNA病毒—》ssRNA -> DNA, 当病毒dna 整合到肝细胞基
因里，搞乱了正常的基因功能，产生癌细胞。当这种癌细胞得不到抑制时——》肝癌。 |
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o*******a
发帖数: 242 | 23 1), 在抗体产生之前，清除病毒不都是T cell 和 innate immunity 引起的。肝细胞自
己会死(apoptosis)，也会被病毒杀死(virus-induced cell apoptosis or necrosis)。
你说“HBV是一种标准的non-cytopathic virus，本身复制对肝细胞不造成病理伤害，
更不会杀死肝细胞，实际上肝细胞损伤主要是由机体自身免疫系统造成的”
这是错误的。我知道上面有人上了文献。 我就很懒得跟你比拼上文献了。你们自己就
会很容易找到很多很多文献证明病毒可以杀死细胞。病毒在肝细胞复制时会杀死肝细胞
这个描述一点问题都没有。我没有必要一个一个的给你列出细胞死亡的机制。you are
out of your mind,才会攻击我这个观点。更合况你的观点并不正确。
2), 还有不知道你从哪儿看到说乙肝病毒不能跨过胎盘屏障，事实上它们可以。所以我
说的没错。你的错了。这也是基本知识而已。
***你强调T cell在抗体产生之前的清除病毒的作用。事实上靠这条路来清除病毒不通
。inteferon等的临床证明他们不会起关键作用。就是说不管你... 阅读全帖 |
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o*******a
发帖数: 242 | 24 乙肝病毒感染后，大部分会自愈，因为人体产生有效抗体。所以很多人自己感染后都不
知道。但是有10-20%的人不会产生有效抗体，会转成慢性病毒携带者（慢性乙肝）。
病毒携带者在pregnancy时会感染胎儿，因为胎儿和小婴儿的免疫系统（T细胞）没有发
育完全，不能产生有效抗体。所以，在胎儿和婴儿时感染大多数都会转成慢性肝炎，成
为病毒携带者。
病毒在肝细胞复制时会杀死肝细胞，但肝细胞能自我复制，死了的肝细胞会由其他分裂
代替。但是如果正常肝的结组织构被破坏了，复制的肝细胞不是一个一个排列在基底膜
上，而是乱长在一起，就会导致肝硬化。如果病毒太仓狂，大部分的细胞都死了，就会
产生爆发型肝炎，死亡率高达60-70%。慢性乙肝炎会产生癌变，导致肝癌。因为
heptatitis B virus 复制是dsDNA病毒—》ssRNA -> DNA, 当病毒dna 整合到肝细胞基
因里，搞乱了正常的基因功能，产生癌细胞。当这种癌细胞得不到抑制时——》肝癌。 |
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o*******a
发帖数: 242 | 25 1), 在抗体产生之前，清除病毒不都是T cell 和 innate immunity 引起的。肝细胞自
己会死(apoptosis)，也会被病毒杀死(virus-induced cell apoptosis or necrosis)。
你说“HBV是一种标准的non-cytopathic virus，本身复制对肝细胞不造成病理伤害，
更不会杀死肝细胞，实际上肝细胞损伤主要是由机体自身免疫系统造成的”
这是错误的。我知道上面有人上了文献。 我就很懒得跟你比拼上文献了。你们自己就
会很容易找到很多很多文献证明病毒可以杀死细胞。病毒在肝细胞复制时会杀死肝细胞
这个描述一点问题都没有。我没有必要一个一个的给你列出细胞死亡的机制。you are
out of your mind,才会攻击我这个观点。更合况你的观点并不正确。
2), 还有不知道你从哪儿看到说乙肝病毒不能跨过胎盘屏障，事实上它们可以。所以我
说的没错。你的错了。这也是基本知识而已。
***你强调T cell在抗体产生之前的清除病毒的作用。事实上靠这条路来清除病毒不通
。inteferon等的临床证明他们不会起关键作用。就是说不管你... 阅读全帖 |
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g*******r
发帖数: 129 | 26 htscorpion: Lenti is an RNA virus...
Maybe the ssRNA genomes are more flexible than dsDNA counterpart, and
there are proteins to pack these RNAs? |
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f*****f
发帖数: 195 | 27 反复冻融跟frost free没啥关系，4C也不存在冻融
rna：影响小，dsrna 稳定，ssrna相对不稳定
dna：几乎无影响
medium：4C
compound主要看其结构本身，protein 或peptide稳定性就比较差
一般而言powder稳定性>>stock solution
实验重复不出来因素太多。 |
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v********a
发帖数: 646 | 28 请问，absorbance of 1 unit at 260 nm corresponds to 40 μg of RNA per ml (
A260 =1= 40 μg/ml).
这个算式，是怎么得来的？
能不能给出原始的计算方法？
谢谢！ |
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z*f
发帖数: 27 | 30 From Wiki:
Using the Beer-Lambert Law it is possible to relate the amount of light
absorbed to the concentration of the absorbing molecule. At a wavelength of
260 nm, the average extinction coefficient for double-stranded DNA is 0.020
(μg/ml)−1 cm−1, for single-stranded DNA it is 0.027 (μg/ml)&#
8722;1 cm−1, for single-stranded RNA it is 0.025 (μg/ml)−1 cm&#
8722;1 and for short single-stranded oligonucleotides it is dependent on the
length and base composition. Thus, an ... 阅读全帖 |
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g*****x
发帖数: 3283 | 32 谢～我来看看
目前我想到的办法是设计DNA杂交，然后用只chop ssRNA的endonuclease把ss
extension全切掉，只看被DNA mask的部分。 |
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w***o
发帖数: 151 | 33 We need add 5'-PO4-RNA to 3'-end of ssDNA
Not adding DNA/RNA to ssRNA |
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c******6
发帖数: 928 | 34 Ying Zhang，Hang Chen，Ju-Guang Han，Insight into the binding modes of Lassa
nucleoprotein complexed with ssRNA by moleculardynamic simulations and free
energy calculations，Journal of Biomolecular Structure & Dynamics，2015，33
（1）：946-960
Run-Ning zhao，S. Fan，Ju-Guang Han，Guang Liu，Molecular dynamics study of
segment peptides of Bax,Bim, and Mcl-1 BH3 domain of theapoptosis-regulating
proteins bound to the anti-apoptotic Mcl-1 protein，Journal of Biomolecular
Structure and Dynamics，2015，33（1）：1067-10... 阅读全帖 |
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