m*********n
发帖数: 215 | 1 为毛要找公司做。。。==|||||| 有你找公司的时间自己都能实验好几个probes了。。 |
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k*****n
发帖数: 323 | 2 你可以试试invitrogen fish的kit，很好用 |
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l***y
发帖数: 4671 | 4 啊。。。看来需要找合作者来做了。。。
要是能用别的某种方法给每个细胞发一个身份证，然后可以 in situ 地查，就太好了
。否则还是没
法区分细胞啊，更不要说 tracking 了。。。想来想去好像也就只有 brainbow 用的这
种方法
了。很奇怪为什么查不到别人做好的 cell line。。。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 5 如果是我, 会首先看看这个基因在什么细胞里表达. 你拿cancer vs normal做
microarray, 比较的是总量/平均量; 而某个基因可能在endothelial vs epthelial里
的功能和表达完全不同.
in situ hybridization |
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s******s
发帖数: 13035 | 6 要做大量的Biotin label的RNA fragment （大概几百bp)，做类似
in situ的实验，大家都用什么kit啊？
我只用过roche的nick translation mix做过DNA的probe, 这个RNA
的是不是质粒前面有个T7/73/sp6就可以了？in vitro transcription
怎么终止啊？还是必须把DNA切下来转录到底？ |
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y****6
发帖数: 196 | 7 try Tyramide amplification (Perkin Elmer) |
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n***3
发帖数: 663 | 8 Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers,
tissues and cells.
Kuznetsov AV, Veksler V, Gellerich FN, Saks V, Margreiter R, Kunz WS.
Nat Protoc. 2008;3(6):965-76.
Please send it to e*********[email protected]
Thanks! |
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j*******e
发帖数: 23 | 9 Postdocs
Multiple postdoctoral positions are available in Dr. Jiankui He’s
laboratory in South University of Science and Technology of China (SUSTC).
Dr. He is building up the Genome Center at SUSTC, with the most advanced
high throughput sequencers such as Illumina Hiseq, Miseq, Ion Torrent and
Roche 454. We are initiating an international collaborative study “The
International Human Immunome Project”. The International Human Immunome
Project aims to sequence the immune repertoire of 10,000 pat... 阅读全帖 |
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T****i
发帖数: 15191 | 10 很多苦逼型老板，自己也是刻苦出来的，认为勤奋是科研成功的必要条件。我讨厌的那
个女AP，有一次跟我聊起来，我说创造性是最重要的，她说”No，你不懂的，我最需要
的就是好好用pipette 的人”。其实，她说的是奴工，不是科学家。如果只是要勤奋的
话，科研就成了自虐，还会有意思吗？
到底勤奋重要吗？重要，也不重要。科研就像练葵花宝典，勤奋就像自宫。当有人告诉
你，欲练神功，必先自宫。那你得好好想想。因为的确有不少例子，说明即使自宫，未
必成功；甚至不用自宫也能成功。当你听老板的话，无比勤奋地投入，最后只能换来心
酸血泪时，你会后悔的。我不相信什么“至少自己拼了全力，不后悔”之类的crap。如
果一个人总是很勤奋，又总是不成功，那得好好反思以下自己的方法甚至自己的
philosophy是否正确。同样，一个老板，整天盯着手下的人，要求勤奋工作，但手下的
人就是不怎么出好结果，那她是不是也得反思以下？可悲的是，很多老板在这个时候，
却不是坐下来好好想想，而是变本加厉push，进入恶性循环。
我以为，科研最重要的是选题（眼光），其次是创造性（方法），再次才是勤奋。没有
前两项，勤奋没有意义，因为... 阅读全帖 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 11 可以in situ, qPCR一个一个confirm
而且可以cross-species comparison
IHC |
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l**********1
发帖数: 5204 | 12 楼主是个半路出家搞Laser scanning confocal microscope (LSCM) 的?
好好看下红宝书/圣经吧
//onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471142727.mb1410s44/abstract
free download link is here:
//webdoc.nyumc.org/nyumc/files/sun-lab/attachments/CPMB.Ch.14.Situ.IHC.pdf
its pp146
UNIT 14.11
Basic Confocal Microscopy
by Carolyn L. Smith
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Bethesda, Maryland
and
//www.olympusconfocal.com/theory/signaltonoise.html
//micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/confocal/index.html |
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l***d
发帖数: 1828 | 13 【 以下文字转载自 Chemistry 讨论区 】
发信人: lrpwd (lrpwd), 信区: Chemistry
标 题: 人民大学39岁化学系主任自杀身亡(转)
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Mar 21 09:01:52 2012, 美东)
http://bbs.sciencenet.cn/home.php?mod=space&uid=585031&do=blog&
16日，人民大学化学系主任曹廷炳教授从高楼跳下后身亡。
曹教授是1973年生，属于青年才俊，北大博士毕业后去哈佛跟随某大牛做了3年博士后
，2005年被人大引进。几年来，科研成就不错，2011年11月还在《德国应用化学》这样
的牛刊上发表论文。
据说，曹自杀原因在于压力过大，而且化学系人际关系紧张。跳楼后留下了遗书，妻子
无工作，孩子很小很小。
人间惨剧啊！看来，人大这样的文科学校，校级领导都是文科出身，确实没有孕育理科
的环境，不适合建立理工科院系，或者说短期内人大校领导想出政绩很难！你看，都出
了人命！！！
愿逝者安息！望生者引以为戒！
曹教授教授简介：
http://chem.ruc.edu.c... 阅读全帖 |
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b********w
发帖数: 37 | 14 A novel three-color, clone-specific fluorescence in situ hybridization
procedure for monoclonal gammopathies
by Gregory J. Ahmann, Syed M. Jalal, Amy L. Juneau, Eric R. Christensen,
Curtis A. Hanson, Gordon W. Dewald, Philip R. Greipp
Cancer Genetics and Cytogenetics (Vol.101, Issue 1)
my email: b************[email protected] |
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n******u
发帖数: 418 | 15 如果变异体已知的话，就generate针对性的antiboy
或者用不同的mRNA probe做in situ，看RNA是否下降 |
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z****u
发帖数: 1007 | 16 现有的probe死活不work 。又不想花时间自己从头做。听说有公司做这个的，有啥信息
提供不。 |
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s****9
发帖数: 932 | 17 Maybe it is the sensitivity issue, not your probe problem. |
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z****u
发帖数: 1007 | 18 倒是想做LNA probe. 不过那一个probe得700多元，有点心疼的说。
有谁拿LNA probe做过ISH没？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 19 Gblock 合成一段反向带T7 promoter的模板直接转录 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 22 >【 在 neverthink (nevernetbug) 的大作中提到: 】
同意 too
plus Alan Turing Reaction–diffusion system 这个理论
how to merge it to RNA and DNA NGS 2.0 or 3.0 data mining ?
for example:
果蝇胚胎发育 WNT system
发信人: cellcreator (cellcreator), 信区: Biology
标 题: Re: 你们经常浏览science和nature杂志不？
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Apr 5 10:28:25 2011, 美东)
不好意思可能会让你失望了，Wnt的diffusion和我们的实验体系其实不太相关，所以我
不太了解，具体怎么测量还真不了解，做immunostaining？in situ？GFP tag？
不过Wnt的diffusion和果蝇胚胎发育早期经典的bicoid、hunchback等morphogen的
diffusion有所不同。bicoid、hunchback等好像都是tra... 阅读全帖 |
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a***e
发帖数: 1010 | 23 you can even use oligoes |
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m*****s
发帖数: 2227 | 26 in situ zymography technique using the quenched fluorogenic substrate DQ-
gelatin |
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m****6
发帖数: 79 | 27 比JNCI和JCI都还要高，不知道几百个surgry excised cancer samples （不是tissue
microarray）biomarker 分析能发到哪？
因为每个sample很大，里面有一半有normal tissue，in situ tumor，还分析了其中的
immune cell，光定量几个蛋白就花了好几个月。
不想发5分以下的，能再多做点啥，发个10分左右的。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 30 请问普通的福尔马林固定的标本，可以用来做RNA in situ hybridization吗？
切片的过程中也没有RNA free，
杂交的时候应该尽量RNA free吧，这个技术是不是容易掌握，
如果有好的protocol，欢迎分享，或者推荐一些简单易学的protocol，
实验室完全没有这方面的经验，周围也找不到专家,
抗体又不好使，没法IHC. |
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h******y
发帖数: 351 | 31 RNA-RNA has a higher Tm than RNA-DNA, so you can use more stringent washing
in your in situ and get better background. In a nutshell, RNA probe is
better than DNA probe. Of course, your RNA probes should be free of any
RNase contamination.
Current commercially available DIG labeling kits is as sensitive as
radioactive labeling kits, although the advantage of using radioactive-
labeled probes is that you can do quantification analysis by densitometry.
The disadvantage of radioactive-labeled pro... 阅读全帖 |
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t***9
发帖数: 21 | 32 如题，年底Phd毕业，做的是老鼠的发育。经常用的technique无非就是各种histology
染色和mRNA in situ hybridization. 文章还在写，估计只能是比较小的杂志。
就是想问问前辈们，这种背景直接进Industry的可能性是不是太小了？地处中西部大农
村，没有什么信息渠道。要如何才能过渡到industry的工作？或者说，如果需要找Post
-doc，针对哪一类老板或者技术什么的会帮助下一步进Industry？
谢谢！ |
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a*****x
发帖数: 901 | 33 其实前一段时间我同事想招会做in vivo histology和in situ的，都没有招到满意的。
不过这种位子都是招有经验的master,不招phd的。 |
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l***y
发帖数: 4671 | 34 举个例子：
细胞中，50% 大致是一种 phenotype A，另外 50% 呈不同的 20 几种 phenotype，其
中占总 population 的 3% 的一种 phenotype R 会对 drug D 产生抗药性。所以如果
直接做 microarray，基本上看不到这种 phenotype R 的特征。
把 phenotype A 分离出来培养几天后，发现只有 50% 的新细胞依然属于 A，同时发现
有 3% 属于 phenotype R。换句话说，这几种 phenotype 在 in situ 条件下会自发形
成稳定比例。
这在 cancer cell 中挺常见的，也是支持 cancer stem cell 的 hypothesis 的一个
依据。
把 phenotype R 分离出来给药，发现其抗药性丧失。只有跟剩下的细胞 co-culture，
R 才会呈现抗药性。也就是所谓的 niche/micro-environments 的影响。
需要做一些 k/d 来验证机理，然后做关键 protein 的 reporter 来 in vivo 地在
single cell... 阅读全帖 |
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l***y
发帖数: 4671 | 35 举个例子：
细胞中，50% 大致是一种 phenotype A，另外 50% 呈不同的 20 几种 phenotype，其
中占总 population 的 3% 的一种 phenotype R 会对 drug D 产生抗药性。所以如果
直接做 microarray，基本上看不到这种 phenotype R 的特征。
把 phenotype A 分离出来培养几天后，发现只有 50% 的新细胞依然属于 A，同时发现
有 3% 属于 phenotype R。换句话说，这几种 phenotype 在 in situ 条件下会自发形
成稳定比例。
这在 cancer cell 中挺常见的，也是支持 cancer stem cell 的 hypothesis 的一个
依据。
把 phenotype R 分离出来给药，发现其抗药性丧失。只有跟剩下的细胞 co-culture，
R 才会呈现抗药性。也就是所谓的 niche/micro-environments 的影响。
需要做一些 k/d 来验证机理，然后做关键 protein 的 reporter 来 in vivo 地在
single cell... 阅读全帖 |
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a********k
发帖数: 2273 | 36 有一个比较小的分泌蛋白，N端1-24是signal peptide。我想用这24个氨基酸做个单抗
用于immunostaining看看这个蛋白是什么组织分泌出来的（有 in situ了，但是还想做
做蛋白），不知道有没有同学做个类似的事情啊？或者大家给看看，成功率大概有多少
？谢谢！ |
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n******u
发帖数: 418 | 37 有没有什么系统介绍mouse work实验手段的书？
包括介绍怎么构建ko/transgenic mouse到各种实验手段（切片，in situ, 各种
staining等），以及原理和troubleshotting的说明
有什么权威系统点的书推荐么？ |
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h******y
发帖数: 351 | 38 冰冻组织切片的时候，对环境温度有一定要求。先问你一个问题，你的是新鲜组织直接
冷冻，还是固定组织后再过蔗糖然后冰冻。这两种不同处理方法得到的标本，最适宜的
温度稍有不同。我的经验是直接冰冻的新鲜组织，切片最佳温度在-20C到-25C。如果是
预先固定并经过蔗糖的标本，切片温度稍高一点，-18C左后最佳。
我常用的方法是给老鼠心脏灌注，先用50mL PBS，再用50mL 4%PFA，再开颅取脑，4%PF
A过夜，然后30%蔗糖过夜（等脑子全部沉到底部）。在一个100mL的烧杯里放50mL Isop
entane，放在干冰上，等温度稳定（丢一小块干冰到isopentane里，没有气泡出来）以
后即可以冻组织。把组织从蔗糖里取出，擦干，放在模子里，灌满OCT，摆正位置，做好
记号（非常重要，因为OCT冻住以后你就看不见组织了）。用镊子拿着装着组织的模子，
迅速放到冷却好的Isopentane中，两分钟后取出来就行了。如果有多个样本，注意Isop
entane的温度要控制好，用小块干冰测试一下（要求没有气泡出来）。
这种方法冻的组织，做全脑的cross section，saggital sec... 阅读全帖 |
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s******r
发帖数: 2876 | 39 有没有用RNAse later之类的溶液灌注老鼠的，
这样的话RNA会不会保存的好一点，in situ
容易一点。
PF
Isop
做好
子，
Isop |
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h******y
发帖数: 351 | 40 冰冻组织切片的时候，对环境温度有一定要求。先问你一个问题，你的是新鲜组织直接
冷冻，还是固定组织后再过蔗糖然后冰冻。这两种不同处理方法得到的标本，最适宜的
温度稍有不同。我的经验是直接冰冻的新鲜组织，切片最佳温度在-20C到-25C。如果是
预先固定并经过蔗糖的标本，切片温度稍高一点，-18C左后最佳。
我常用的方法是给老鼠心脏灌注，先用50mL PBS，再用50mL 4%PFA，再开颅取脑，4%PF
A过夜，然后30%蔗糖过夜（等脑子全部沉到底部）。在一个100mL的烧杯里放50mL Isop
entane，放在干冰上，等温度稳定（丢一小块干冰到isopentane里，没有气泡出来）以
后即可以冻组织。把组织从蔗糖里取出，擦干，放在模子里，灌满OCT，摆正位置，做好
记号（非常重要，因为OCT冻住以后你就看不见组织了）。用镊子拿着装着组织的模子，
迅速放到冷却好的Isopentane中，两分钟后取出来就行了。如果有多个样本，注意Isop
entane的温度要控制好，用小块干冰测试一下（要求没有气泡出来）。
这种方法冻的组织，做全脑的cross section，saggital sec... 阅读全帖 |
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s******r
发帖数: 2876 | 41 有没有用RNAse later之类的溶液灌注老鼠的，
这样的话RNA会不会保存的好一点，in situ
容易一点。
PF
Isop
做好
子，
Isop |
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s******9
发帖数: 283 | 42 我们在做基于protein display和in situ DNA sequencing的single molecule protein
array。可以不用分离蛋白，throughput到～1 billion protein molecules/slide，
可以screen library against library。希望文章不久能出来。 |
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s******9
发帖数: 283 | 43 文章在revision中，在技术上很难几句话就说请。但是原理简单，就是in vitro
generate DNA barcoded proteins，用DNA barcodes识别蛋白。
In situ sequencing是NGS未来一个重要分支，可以分析cluster的pattern，提供
更丰富的信息。 |
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y**********o
发帖数: 37 | 44 最近一直在考虑career的问题，估计是年纪大了，想安定了。
个人背景：国内三流医学院毕业，国内生物硕士，加拿大生物硕士，毕业后留实验室做
技术员一年多。
目前考虑一年内办好移民后换份工作。个人没什么太大的追求，只想有份稳定、收入说
得过去的工作。考执照做医生是基本不去想了，不知道还有没有其它的选择。
以前读书的时候一直忙于实验（老板比较push),从未认真考虑过这个问题。
技术方面主要做分子和细胞的实验，目前管理10多个mouse lines,可以做MCAO,brain
injection这样的实验，也可以做切片、染色以及in situ。所做课题和metabolism相关
，GTT,ITT以及分离各种老鼠组织都非常熟练。不知是否有机会去一些公司做
metabolism相关的研究？
另外考虑过读个physician assistant的学位去医院工作，似乎更稳定点。
希望有经验的指点指点，谢谢！ |
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m*******r
发帖数: 202 | 45 Cell Cycle. 2005 Mar;4(3):453-5. Epub 2005 Mar 7.
Cell cycle markers for live cell analyses.
Easwaran HP, Leonhardt H, Cardoso MC.
SourceMax Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin, Germany.
Abstract
Many cellular processes are regulated by cell cycle dependent changes in
protein dynamics and localization. Studying these changes in vivo requires
methods to distinguish the different cell cycle stages. Here we demonstrate
the use of DNA Ligase I fused to DsRed1 as an in situ marker to ident... 阅读全帖 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 47 In Situ Hybridization of Whole-Mount Mouse Embryos with RNA Probes:
Preparation of Embryos and Probes
Cold Spring Harb Protoc; 2007; doi:10.1101/pdb.prot4822 |
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T****i
发帖数: 15191 | 48 不少实验有其他实验可以替代，不是非做出来不可。比如做个克隆，有时候老方法不出
来，用别的方法，比如InFusion就得了。再比如，in situ hybridization 有时不好做
，为什么不换新方法，现在好几家公司开发了新方法。只要有钱买好试剂好Kit，大多
数实验都enjoyable。没钱，没钱也配作实验？ |
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