m*********D
发帖数: 1727 | 1 I used 2 guide sequences for co-transfection in case one of them did not
work. From my sequencing result, both of them worked. |
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g****g
发帖数: 74 | 2 好奇的问一下
tracr 是那个Charpentier发现的
那crrna是谁发现的，cas9又是谁发现的
还有你漏了最重要的一个pam 到底是谁发现的pam呢，又是谁这么聪明把crrna 和tracr
变成一个sgrna呢
这样已经有四－5个重要原件了😄太有意思了
Charpentier |
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g****g
发帖数: 74 | 3 好奇的问一下
tracr 是那个Charpentier发现的
那crrna是谁发现的，cas9又是谁发现的
还有你漏了最重要的一个pam 到底是谁发现的pam呢，又是谁这么聪明把crrna 和tracr
变成一个sgrna呢
这样已经有四－5个重要原件了😄太有意思了
Charpentier |
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c****r
发帖数: 126 | 4 http://www.tang-prize.org/media_detail.php?cat=23&id=494
2016 Jun. 19
唐獎生技醫藥獎得主基因編輯技術 有望治療各種疾病
唐獎評選委員會總召集人、中研院院長李遠哲今公布唐獎生技醫藥獎得主，由法國的伊
曼紐．夏彭提耶（Emmanuelle Charpentier）、美國的珍妮佛．道納（Jennifer A.
Doudna）與華裔美籍的張鋒（Feng Zhang）三人共同獲得，表彰其在CRISPR/Cas9基因
編輯技術上的貢獻，將大幅改革生醫研究與疾病治療的策略，極具潛力治療人類各種疾
病。
李遠哲總召集人表示，這三位得獎人在基因編輯技術上的突破與影響深遠，除疾病治療
上，也將影響生醫、製藥及農業的發展，如玉米中有些人體無法消化的澱粉，在尊重自
然法則運作、不人為添加的前題下，透過這個編輯技術，即可把不能消化的基因去除掉
，因此，在未來農業的發展與影響會更快更直接。
擔任得獎者介紹人的中研院院士龔行健表示，基因體是人類生命的藍圖，結構上的缺失
或基因表現的異常，釀成許多人類疾病，長久以來，科學家夢想有朝一日可以精準有效
... 阅读全帖 |
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m****p
发帖数: 122 | 5 最近在做利用lentivirus表达sgRNA KO一个基因，转染第一步就出现问题。
针对两个位点病毒是sigma定制的，寄给我的滴度是5*10^6/ml和1*10^6/ml，我用它们
转了两个细胞（12孔板，每个孔10微升病毒），该病毒正常应该有GFP及puro抗性基因
表达的，我在转染24小时和48小时居然没有看到任何荧光。
我原来用过santa cruze的shRNA病毒，转染后用puromycin筛选，转染效果还是可以的
，最后也筛选出了我要的单克隆细胞。
有人遇到过我现在这个情况吗？怎么解决？
谢啦 |
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f******k
发帖数: 856 | 6 我有点疑惑，你说你拿到的是病毒，怎么还转染（transfection）？你是说转导（
transduction）吗？
你的细胞是不是感染效率不高呢？可以尝试spin infection外加用polybrene （4ug/ml
)。在我手里用spin infection和polybrene一起的话可以把在B细胞的感染效率提到90%
甚至95%以上。
不过我都是自己克隆sgRNA进lentiviral vector，然后转染293细胞做病毒。如果是
sigma做的病毒有问题，你没办法知道。 |
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z*t
发帖数: 863 | 7 楼主如果细胞能够进行单细胞筛选，那我强烈推荐用sgRNA+Cas9 protein做RNP
complex
这个complex打电转效率很高，很推荐用paired guide可以做deletion，容易探测，不
存在质粒系统中像楼主提到的问题，我们用CD34+细胞可以达到90%的target effiency |
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c****1
发帖数: 1095 | 8 具体怎么做？人工合成sgRNA，重组的Cas9?
有参考文献或者protocol么？多谢！！
effiency |
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z*t
发帖数: 863 | 10 inducible目前不好做
可以稳转Cas9+ inducible sgRNA，这个是目前我觉得最靠谱的.
至于inducible Cas9之前有兄弟说了不一定work，我们的经验是还会有Cas9的leakness. |
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z*t
发帖数: 863 | 11 RNA其实没那么难做，尤其sgRNA.不过这个基本上任意dna可以修饰了。
比较麻烦的一点是ssDNA对细胞有一定毒性
：1. DNA 比RNA更稳定，working with RNA is a pain in the ass.
：2. 削减了gRNA并非用于matching的冗余部分，精简了Primer
：PAM对于精确任意修改DNA(这是这个技术的selling point之一)是非常重要的阻碍。我
：认识
：的几个做CRISPR的实验室都在尝试解决这个问题。
：这几点看上去可能没什么大不了的，但是要知道crispr/cas9之所以热，并不是因为它
：实现了什么以前不能做的事，只是让以前很难做的事现在变的容易了。让真核生物的
基因组改造普及化；而这个技术有潜力让基因组改造白菜化。 |
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z*t
发帖数: 863 | 12 胖老师的科学敏感性好棒
其实不用想NgAgo，cas9现在大家已经在玩蛋白+sgRNA（RNP）了，好用的一逼
而且质粒这个用在primary cell上要克隆+大抽麻烦爆了，现在的RNP方便程度和效率上
从单独的gene editing角度完爆plasimid。而用RNP真的让crispr在临床的应用有了点
希望
唯一的一点是NgAgo不能做screen，这个确实限制了这个技术的应用。 |
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b*****n
发帖数: 1841 | 13 假设Cas9已经在DNA上切了一刀了，那么究竟是添加或者去除1，2,3个碱基是完全随机
的吗？如果是这样，不是意味着有三分之一的可能性不会移码突变？
如果以上猜测正确，能否表达多个sgRNA在一个基因上不同的位置编辑从而提高移码突
变的可能性？ |
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j******i
发帖数: 939 | 14 不会真的有造假吧
From Google Group
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Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide
Hi, Davide,
I tried the same plasmid that you used to target DYRK1A, HBA2, GATA4, which
are tested in Han's paper, but I didn't see any indel as they did. It seems
there is something wrong with this sy... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 15 Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide |
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发帖数: 1 | 16 我们现在要做PD1基因CKO的小鼠模型，想请教一下几个问题：
1.如果用CRISPR插入LOXP位点的方法，是要插在整个基因编码区的两侧？还是选择少数
几个外显子让其移码突变？
2.在操作的时候如果同时注射两个sgRNA，会不会直接把中间的片段删除掉了而导致敲
入LOXP的效率比较低呢？
求教！ |
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h**********r
发帖数: 671 | 17 请教楼主一个问题。构建sgRNA表达的时候，是不是转录起点之后尽量少加额外的序列
？我的顾虑是很多启动子的转录起点其实不是特别清楚。在做基因表达的时候，找ATG
就行了。但是不清楚多余的5‘序列对整个Crispr-cas9效率的影响。
我附上了一个简图供参考。多谢！ |
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发帖数: 1 | 18 It's an interesting question. To the best of my knowledge, no RNA-seq
alignment tool was designed to tolerate CRISPR-mediated indels to date. I'm
not an RNA-seq expert, so it's possible that there are some on the way. You
can also email Luca Pinello, the author of CRISPResso. He might know more,
and he's a really nice guy.
Here I'm trying to think about a solution. There are two situations - I don'
t know which one is your case.
a) The sample for RNA-seq was derived from a single mutant clone. I... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 19 特别记录
信息来源：
- Nature News
- 2016.11.23
Title:
NgAgo gene-editing controversy escalates in peer-reviewed papers
Subtitle:
One paper describes surprising results in zebrafish embryos, another lists
failed replication efforts.
By: David Cyranoski
link：
http://www.nature.com/news/ngago-gene-editing-controversy-escalates-in-peer-reviewed-papers-1.21023
Key points
- 作者采访了最新两篇NgAgo peer reviewed article的相关人员 （包括Dr Wensheng
Wei 和 Dr Zhang Xiaoxue）， 回访了韩春雨以及第一篇Nature editorial里采访过的
一些实名及匿名科研人员， 也回访了方舟子
- ... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 20 特别记录
信息来源：
- Nature News
- 2016.11.23
Title:
NgAgo gene-editing controversy escalates in peer-reviewed papers
Subtitle:
One paper describes surprising results in zebrafish embryos, another lists
failed replication efforts.
By: David Cyranoski
link：
http://www.nature.com/news/ngago-gene-editing-controversy-escalates-in-peer-reviewed-papers-1.21023
Key points
- 作者采访了最新两篇NgAgo peer reviewed article的相关人员 （包括Dr Wensheng
Wei 和 Dr Zhang Xiaoxue）， 回访了韩春雨以及第一篇Nature editorial里采访过的
一些实名及匿名科研人员， 也回访了方舟子
- ... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 21 140nt？你是表达sgRNA吗？为什么不直接用Fengzhang的PX330，PX459一类已经构建好
的质粒。 |
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发帖数: 1 | 22 独家专访：面对质疑的韩春雨
原创2016-10-18 陈晓雪、李晓明 知识分子
►韩春雨任教的河北科技大学门口。摄影：陈晓雪
内文提要：
独家专访：面对质疑的韩春雨
韩春雨NgAgo论文可重复性争议考验科学界
编者按：
5月初，《知识分子》以国际科学媒体的标准，第一时间报道依据国际科学同行
评议的学术刊物上发表的韩春雨论文以及当时多位科学家评论，并说明其是发展了荷兰
科学家的工作。此后，国内媒体和单位纷纷跟进，因为没有新的工作进展，《知识分子
》未继续报道。从网上开始有声音质疑韩春雨文章结果，《知识分子》一直保持追踪国
内外学术界最新的动态，但不依据私下匿名来源为主作报道，直到13位中国科学家公开
实名发言后，《知识分子》才有可以较为完整、公开的事实可以报道。
NgAgo实验的可重复性争议历经数月之久，至今虽有多方表态，但仍然没有迹象显示很
快会得到解决。如何在学术规范下寻找解决之道，是摆在中国科学界面前的重要挑战。
10月10日晚，12位科学家实名呼吁调查（后增加一名科学家），《知识分子》
当晚连线韩春雨，并于第二日中午赶赴河北科... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 23 Sci Rep. 2016 Dec 2;6:38198. doi: 10.1038/srep38198.
Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in
patient-derived iPSC by Cas9 nickase.
Eggenschwiler R1,2, Moslem M1,2, Fráguas MS1,2, Galla M3, Papp O1,2,
Naujock M4, Fonfara I5,6, Gensch I1,2, Wähner A1,2, Beh-Pajooh A1,2,
Mussolino C7,8,9, Tauscher M10, Steinemann D11, Wegner F4, Petri S4,
Schambach A3, Charpentier E5,6, Cathomen T7,8,9, Cantz T1,2,11.
In order to help enforcing bi-allelic targeting with the new ... 阅读全帖 |
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h*******u
发帖数: 126 | 24 大家好！
我们实验室主要做基因功能分析，但是在某次实验中我们偶然发现特定的操作，可以
提升CRISPR基因编辑的效率，请问应该从哪些方面入手研究机制？ 比如CAS9结合的多
了？还是sgRNA铆钉的多了，做CHIP，什么的吗？
CRISPR不懂。 谢谢各位大神！ |
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发帖数: 1 | 26 我倒不那么认为，我不觉得作者会那么low。问题是人家就那么随随便便一测就能发现
如此多的随机突变，这个从概率上来说，已经可以说明问题了。不要因为不喜欢别人的
结果而坚持要推翻别人的结论。
在supplementary的数据中写道：FVB/NJ mice, which are inbred and homozygous
for the retinal degeneration 1 (rd1) allele of Pde6b, were purchased from
The Jackson Laboratory, (Bar Harbor, ME). Co-housed FVB/NJ mice without
CRISPR-mediated correction were used as the functional-deficient control.
Briefly, an sgRNA- expressing plasmid had been coinjected, into FVB/NJ
zygotes, with the single-stranded oligodeoxynucle... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 27 没用CRISPR作过动物。记得是直接注射sgRNA/Cas9 mRNA到受精卵里面？测DNA序列就是
尾巴拿一节下来提genomic DNA？这个过程我有点担心的是，Cas9是在受精卵水平就发
生了，还是在后面一段时间里都可能发生。我个人在细胞水平作的时候，有这个考虑，
就是Plamisd（含guide/Cas9/HDR-template)transfect到细胞之后，等了五天，再
split，然后等单克隆。我担心的就是一个细胞接受了plasmid，但这个cas9/HDR过程不
是马上发生，不等几天（我个人经验是expression plasmid表达的基因至少有四天往上
的活性）split，很可能挑出来的克隆是不单一的。
我五天后split，挑的单克隆里，有一个克隆至少后面confirm了，是一个single-
replacement/double-replacement的mix。这个之所以发现了，是因为single-
replacement的细胞最后长得快，过了两个月发现表型有些不一样，再作genotyping，
才确定的。回头看了我两个月前的genotyping图片，确实有一条很... 阅读全帖 |
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t*******w
发帖数: 107 | 28 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28557981/#comments
FYI all.
Xiaolin Wu2017 May 31 2:11 p.m. (6 days ago) 9 of 9 people found this
helpful
This paper raises important safety issue for gene therapy application of
CRISPR-Cas9. However, there are serious doubts about the results or
interpretation. First of all, the authors listed Top-10 predicted off-target
sites. But all genes are wrong! looking at the sequence they listed (supp.
figure 3), you will not be able to find it in the genes! After ca... 阅读全帖 |
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