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w******a
发帖数: 1527 | 2 Check this one:
Reagents
* TRIzol from Invitrogen #15596-108.
* Mini RNeasy plus kit from Qiagen #74134.
* Phase lock gel from Eppendorf #2302830.
* Keep TRIzol at 4C.
* Use RNase-free tubes and tips for all steps.
* Prepare 70% ethanol using DEPC-H2O and keep it at -20C.
RNeasy plus kit contains a genomic DNA elimination column. It can replace
the DNase I digestion step of regular RNeasy kit.
1. Add 1.2 ml TRIzol reagent to cells/tissues (5~10X 106 cells/ml or 50~100
mg ... 阅读全帖 |
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T**********r
发帖数: 287 | 3 从组织里分离细胞，之后FACS，直接sort到RLT裂解液里（from Qiagen RNeasy plus
mini kit),
获得cell 数量约20000，之后用RNeasy kit提取RNA，获得的RNA送去gene-profiling,
总是说质量
不好。
求有经验的同学给些建议，感激不尽。 |
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x********u
发帖数: 430 | 4 The procedure I found in the literature;
1) grow E. coli to late-exponential phase
2) extract total RNA with RNeasy Protect Bacteria Mini Kit(Qiagen)
3) purify RNA by RNeasy Mini Kit(Qigen) spin column
4) send samples to xxxxx University Functional Genomics Core Facility for
amplication, labeling and hybridization to the Affymetrix GeneChip E. coli
genome 2.0 Array.
5) Data analysis by MatLab bioinformatics toolbox
Question: For amplication of total mRNA and labeling of the resulting cDNA
in ste... 阅读全帖 |
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l********e
发帖数: 415 | 5 Rneasy Kits worked fine for us.
You do need to remove DNA as they can be incorporated into the sequencing
library.
However, DO NOT perform the standard on-column DNase treatment as it lead to
dramatic sample loss and often times not complete. I would just Dnase the
sample after purification and heat inactivate.
Please note that the regular Rneasy columns do not work well with RNA <
200bp. Therefore, if you want to look at small RNA, you might need a special
kit. |
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a******n
发帖数: 45 | 6 如果RNA量大的话， trizol 》DNase I treatment 》Qiagen RNeasy Mini Kit
purify。 量小的话，RNeasy plus micro kit或者Life Arcturus Picopure RNA
isolation Kit， on column DNase digestion。不要直接用trizol提的RNA做library
，纯度不够。 |
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C*I
发帖数: 4736 | 7 一直在误导，现在还在误导。 说说明corona virus 不可以从蝙蝠直接传染给人，必须
经过一个中间宿体性的其它动物才能传染给人。所以，病毒发生后，就故意误导全国人
民去海鲜市场找证据，找其它野生动物的麻烦。 而且还是病毒所去找的，找完了还装
模做样化验呀，分离呀什么的。最后把责任全部推给了海鲜市场的动物。可是那种动物
，一直不敢说，说了其它相关已经在人就会去早那种动物监测。 所以压根不说，打马
虎眼。
事实上，早在2013 年，就是这个武汉病毒研究所，已经从来自云南的蝙蝠身上所携带
的corona virus中分离出第一株蝙蝠SARS类似样的冠状病毒的活病毒，其中就包含了类
似于S类型的基因。从而证实这株病毒能够使其接受和SARS病毒相同的受体，并能够感
染人的细胞。对此新发现，武汉病毒所还把它以武汉病毒研究所的英文简称命名“WIV1
”，以彰显这一发现的重要价值和属于自己第一个发现的巨大研究成果。这个成果刊载
于2013年11月的《自然》杂志。
就是说，从云南弄回来的这种蝙蝠所携带的类似于sars的 corona virus， 可以不经过
其它受体/宿体，而直接传染给人。 他们... 阅读全帖 |
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C*I
发帖数: 4736 | 8 一直在误导，现在还在误导。 说说明corona virus 不可以从蝙蝠直接传染给人，必须
经过一个中间宿体性的其它动物才能传染给人。所以，病毒发生后，就故意误导全国人
民去海鲜市场找证据，找其它野生动物的麻烦。 而且还是病毒所去找的，找完了还装
模做样化验呀，分离呀什么的。最后把责任全部推给了海鲜市场的动物。可是那种动物
，一直不敢说，说了其它相关已经在人就会去早那种动物监测。 所以压根不说，打马
虎眼。
事实上，早在2013 年，就是这个武汉病毒研究所，已经从来自云南的蝙蝠身上所携带
的corona virus中分离出第一株蝙蝠SARS类似样的冠状病毒的活病毒，其中就包含了类
似于S类型的基因。从而证实这株病毒能够使其接受和SARS病毒相同的受体，并能够感
染人的细胞。对此新发现，武汉病毒所还把它以武汉病毒研究所的英文简称命名“WIV1
”，以彰显这一发现的重要价值和属于自己第一个发现的巨大研究成果。这个成果刊载
于2013年11月的《自然》杂志。
就是说，从云南弄回来的这种蝙蝠所携带的类似于sars的 corona virus， 可以不经过
其它受体/宿体，而直接传染给人。 他们... 阅读全帖 |
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C*I
发帖数: 4736 | 9 Published: 30 October 2013
Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the
ACE2 receptor
Xing-Yi Ge, Jia-Lu Li, Xing-Lou Yang, Aleksei A. Chmura, Guangjian Zhu,
Jonathan H. Epstein, Jonna K. Mazet, Ben Hu, Wei Zhang, Cheng Peng, Yu-Ji
Zhang, Chu-Ming Luo, Bing Tan, Ning Wang, Yan Zhu, Gary Crameri, Shu-Yi
Zhang, Lin-Fa Wang, Peter Daszak & Zheng-Li Shi
Nature volume 503, pages535–538(2013)Cite this article
Abstract
The 2002–3 pandemic caused by severe acute respirator... 阅读全帖 |
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M****e
发帖数: 70 | 10 i have never worked with plant, so i do not know whether this
could be due to sth that cuase higher obsorbance at 260nm.
the ratio for isolated RNA from animal tissues is usually 1.7-
2.0 for my experience, and it pretty much depends upon what
kind of kit/reagent i use. i try TRIZol (Invitrogen), which
is pretty good, but sometimes RNA from pancreas will degrade
with no mercy. i also use RNeasy Kit (Qiagen), which is said
to be better, particularly working for microarray purpose.
i would recomme |
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y******y
发帖数: 107 | 11 说明书似乎没有介绍可以提取bacteria 的 total RNA，但是可以提取yeast的total
RNA，不知能不能用来提取bacteria 的 total RNA？谢谢。 |
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y******y
发帖数: 107 | 14 是否可以用里面的提取yeast的方法提取bacteria的RNA？yeast的细胞壁和bacteria的
细胞壁应该是不是差不多？ |
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y******y
发帖数: 107 | 16 是的，要另外多买一个RNAprotect Bacteria Reagent 。多谢！ |
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y***j
发帖数: 11235 | 18 做一个实验， 细胞需要染色然后sort一下再提RNA。
染色至少冰上30min，另外再flow cytometer里有几十秒钟的时间温度会升到RT甚至更
高.会不会有影响呢？
formalin fix一下再染色会不会影响下一步的RNA提取呢？准备用qiagen的RNeasy
micro kit.
或者有什么其他专门的可以再进细胞的RNAse inhibitor么？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 19 没问题，无穷这种FFPE“ formalin-fixed, paraffin-embedded tissue”
的kit，比如qiagen rneasy ffpe kit |
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C*****h
发帖数: 926 | 20 为什么不用Qiagen的RNeasy Kit?
过一下柱子，就是很纯的RNA。
不需要extraction，也不需要precipitation |
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w***a
发帖数: 4361 | 21 Macrophages seem to be different from other cell types. I have exactly
the same experience before. Eventully, I switched to Qiagen RNeasy Kit
for RNA extraction. The yield is lower, while the RNA quality is good enough. |
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O*********e
发帖数: 79 | 22 天，这个都会上首页。。
多谢wdgca的回复，我也觉得是macrophage的问题。下次用那个kit试试看
不是干透的问题，我提RNA已经有4年了，从来不用speed vacuum，都是风干的，pellet
一变透明就加TE。TE和water我都用过，做microarray的样品用nuclease-free water，
其他没那么高质量要求的时候就用TE，没发现什么区别。还有我前面说过，我同时提的
macrophage和splenocyte的RNA，后者一点问题都没有，macrophage的RNA pellet其实
还小些，但就是不溶。昨天折腾了好久，还是能看到薄薄的一片pellet飘在管子里，但
测 OD到了100ng/ul，足够一个反转录PCR了,就将就着用了。下次一定试试那个Qiagen
RNeasy Kit。也给以后要提macrophage RNA的同学提个醒，really tough pellet，要
是样品宝贵的话不要自己提，直接上kit。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 23 I use miRNeasy from qiagen.
Please notice that RNeasy will not yield miRNA or other small RNA. |
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a********k
发帖数: 2273 | 24 Qiagen RNeasy就很好用，如果是全鱼的话用他的fibrous tissue的kit更好 |
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w********h
发帖数: 12367 | 25 which one do you prefer?
Fisher sales told me Promega is superior. |
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h******y
发帖数: 1374 | 28 搭车问，Trizol处理后的样品如果在一周内提取mRNA，是放在－20还是－80的冰箱好？ |
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E****A
发帖数: 184 | 30 没用过promega，但用过qiagen和invitrogen的，发现qiagen的kit提出来的rna都特别
漂亮 |
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s****a
发帖数: 454 | 31 真的是太感谢了.
组织匀浆的时候加了50U/ml的RNAsin,还用不用加heparin了?用的一般浓度多少?
我还没有注意到这个gradient有W/V,W/W的区别.我用的是W/V,那我就是还需要加两个
gradient?我的是10ml的gradient.15-50W/V的话,那就是差不多1.25ml一个5%的梯度.我
的是机器上的梯度.不过谢谢你的手动梯度的方法.
取样的话,我们这里没有realtime的UV reader.所以不是很准.我现在想, 要不要改成
250ul一个fraction.
上样之前我没有测OD,只是去了30mg的组织.那我等下次预实验的时候测一下.
还有,就是组织匀浆可以冻存吗,还是每次要新鲜配置?
收集的fraction我想用RNeasy Plus minikit来提RNA,正在看手册,不知道这么多的蔗糖
会不会太绸 |
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F*****e
发帖数: 182 | 32 准备从wildtype和mutant的老鼠里取mouse tissue，提取total RNA后做mRNA seqencing。
在犹豫是用Trizol还是Qiagen RNeasy Protect Mini Kit，因为需要先取胚胎，然后
PCR鉴定genotype，之后才能决定需要做哪个，因此最好能将tissue保存一段时间。
Qiagen的kit里面有一个RNAlater RNA Stabilization Reagent，号称tissue放在里面
可以4度保存4周而RNA不被降解，真的这么安全么？有没有用过这个kit的朋友。
另外mRNA sequencing给的结果到底有多可信？定量分析怎么样？多谢。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 33 提RNA的kit不贵，你完全可以全部都提，
等genotype结果出来吧不要的扔掉。
准备从wildtype和mutant的老鼠里取mouse tissue，提取total RNA后做mRNA
seqencing。
在犹豫是用Trizol还是Qiagen RNeasy Protect Mini Kit，因为需要先取胚胎，然后
PCR鉴定genotype，之后才能决定需要做哪个，因此最好能将tissue保存一段时间。
Qiagen的kit里面有一个RNAlater RNA Stabilization Reagent，号称tissue放在里面
可以4度保存4周而RNA不被降解，真的这么安全么？有没有用过这个kit的朋友。
另外mRNA sequencing给的结果到底有多可信？定量分析怎么样？多谢。 |
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m*****l
发帖数: 28 | 34 是tissue 还是cell culture？
Qiagen RNeasy Lipid Tissue kit 挺好用的。
宁缺毋滥，宁可少取点也要保证取的干净。
实在还有问题， 用一种带胶状分层物的2ml tube （忘记名字和公司了）， 离心完gel
状物会把
两相给分隔开。 |
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m*******m
发帖数: 127 | 35 我用phenol／chloroform提取时也常有这个问题，最后发现两相分离时要格外小心，离
心两次就好了。
用RNeasy倒是没这个问题，不过我第二次洗离心后转移到干的collection tube里，再
离心至少两分钟，如果是Nano column的话离心5分钟。 |
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i****t
发帖数: 58 | 36 今天提取RNA,方法是先trizol碾磨保存样品（取样品要用很长时间，不能马上提取），
然后解冻加chloroform（200ul/1ml Trizol）离心取上清液,再直接用RNeasy kit提取
（就是先ethanol再...）。得到的RNA，260/280很好，但260/230较低。大家能否给点
建议，能怎样纯化一下，得到的RNA量较低（35ng/ul for 25 ul）？RNA是用来做qPCR
的，担心是不是phenol而影响酶活性。谢谢 |
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s******s
发帖数: 13035 | 37 担心就再chloroform抽一下， rneasy。我估计没问题，260/230这个指标
有时候我用机器做，同样的aliquot会差很多
qPCR |
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f****y
发帖数: 7425 | 39 请问这个kit的那个on column DNase digestion靠谱吗？
看到protocol上写的是先Dnase I 加buffer挂在柱子上，然后加样品洗脱
感觉样品和柱子接触充其量也就是10分钟不到，而且是室温，不知道DNA能不能除净啊？
以前没有这方面的经验，请大家帮忙指导，不胜感激。 |
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w***a
发帖数: 4361 | 40 能除干净，偶以前经常用。
而且做过control，过不过这个柱子，区别还挺大。
啊？ |
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s****9
发帖数: 932 | 41 同意，这个步骤很重要。有没有加，有时候dissociation curve都不一样。 |
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f****y
发帖数: 7425 | 42 非常感谢
我一开始以为要把样品和DNA酶一起在柱子上放15分钟，反复看发现就是先放酶然后直
接上样品过。有点不敢想象。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 43 我用过，不靠谱。 不如在反转录之前单独加一步除DNA的。 |
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I***a
发帖数: 13467 | 45 用了很多，
有的干净有的不干净，
大多数要再除。 |
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o*****a
发帖数: 2335 | 47 不是先把样品挂上柱子再加DNaseI反应15分钟吗 |
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t**********8
发帖数: 223 | 48 这个kit说可以不用加dnase,大部分dna已经除掉了，对pcr一般没有影响。我试过 RT前
加dnase 和不加，用SYBR Green做qpcr，没有什么区别。但不知道对microarry有影响
吗？
啊？ |
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d**********t
发帖数: 20415 | 50 取决于你的目标基因吧，本身高表达的基因ＤＮＡ的影响可以忽略不计，但是本身表达
很低的基因残留的ＤＮＡ影响是很明显的 |
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