s******y
发帖数: 220 | 1 做WB，我用ripa extract蛋白， 用公司commercial的ripa，借用别人配的， 反正没有
带，
反倒是用tris buffer 没问题，
我觉得tris buffer 太弱，膜蛋白搞不出来，可是ripa为啥不work呢？ |
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s******y
发帖数: 220 | 2 我用ripa buffer从tissue里面提取蛋白做western blot，但是不知道为什么，整条
lane看上去都是一
条黑的，相反，用一般的tris buffer做的看上去就正常。
我用的是santa cruz买的ripa buffer，难道是buffer 坏了？ |
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I*****y
发帖数: 6402 | 3 这RIPA buffer还要买吗？
自己配的RIPA用到PHD毕业都没坏过，呵呵 |
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p******i
发帖数: 1092 | 4 ripa的detergent還蠻強的
RIPA各個公司賣的成分不同，你仔細看看…… |
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M*****n
发帖数: 16729 | 5 ripa不容易坏
santa crappy的质量比较差。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 6 你的方法没有问题，大部分实验室都这么做的。但是我不建议你和老板顶牛，你最好是
要分清矛盾的主次，不要为了这种小事情和他翻脸。
用RIPA buffer 并不能保证所有蛋白都溶解，而且里面的detergent 会干扰
Bradford protein assay,这个在大部分bradford assay的技术说明书里会提到。
你可以拿一个已知浓度的蛋白(such as BSA)，一半溶在PBS, 一般溶在RIPA buffer,
然后做这个Bradford assay, 体会一下，
你会发现溶在RIPA buffer 里的蛋白的数值和PBS里的不一样，而且仪器上
读出来的数值不稳定，每次重复测量读出来的数值都大大的不同。
注意先不要告诉老板！先自己偷偷做一个，心里有数，然后再跟老板讨论，装作
谦虚的说你听说RIPA buffer 有这个问题，然后建议你们作这个实验，然后
再当面重新作一次给他看. 注意这个顺序不能颠倒！一定要自己先做一次，知道
结果了，然后才装着和他讨论装着你是第一次做这个实验。
千万千万不要直接第一次就作给他看！否则万一你们的蛋白有问题，
或者你们的UV spec 有问 |
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h**2
发帖数: 2841 | 7 我觉得你们实验室肯定有成熟的protocol，我这就给你一个我们的RIPA Whole Cell
Extracts protocol吧，用了20年应该不止了 hh
6-well为例
细胞用~1 ml chilled PBS洗一遍
加600 ul 冰PBS，用scraper刮下来，transfer to eppendorf tube
3000 rpm 4C离心3~5min，去上清
离心的同时准备RIPA buffer，我们用的是thermo scientific的Halt protease和
phosphatase inhibitor 100x cocktail
根据cell pellet大小加适量RIPA，一般35mm well的话65~120 ul差不多了，pipetting
up and down till the pellet dissolves，有的细胞蛋白或者DNA content比较高感
觉会比较粘稠，适量增加一点RIPA
拿去sonicate，break genomic DNA，program的话因sonicator而异，不过你不做ChIP
的话问题不大，每个tube s |
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s******r
发帖数: 2876 | 8 35 mm才用100 ul，
那一般浓度范围多少？
loading多少蛋白/well？
我觉得你们实验室肯定有成熟的protocol，我这就给你一个我们的RIPA Whole Cell
Extracts protocol吧，用了20年应该不止了 hh
6-well为例
细胞用~1 ml chilled PBS洗一遍
加600 ul 冰PBS，用scraper刮下来，transfer to eppendorf tube
3000 rpm 4C离心3~5min，去上清
离心的同时准备RIPA buffer，我们用的是thermo scientific的Halt protease和
phosphatase inhibitor 100x cocktail
根据cell pellet大小加适量RIPA，一般35mm well的话65~120 ul差不多了，pipetting
up and down till the pellet dissolves，有的细胞蛋白或者DNA content比较高感
觉会比较粘稠，适量增加一点RIPA
拿去sonicate，break genomic DNA，pr |
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D*a
发帖数: 6830 | 9 你太闲了。
换个情境你体会一下。
Marissa Mayer, Yahoo的CEO
Mayer在Google的努力工作是有目共睹的，她连续几周工作130小时，只剩下一小部分睡
眠时间。
英国《卫报》报道,她一天只需要4到6个小时来睡觉。她每四个月只用一个礼拜的度假
来充电。
Jack Dorsey, Twitter的创始人和Square的CEO
在创建两个令人兴奋的高科技企业开始的阶段，他并未留下很多的休息时间。2011年
Jack Dorsey告诉我们，他一天花费8-10个小时用在Twitter上，另外花费8-10个小时用
在Square中。
这让他每天睡眠时间只剩下4-6个小时，这还要算上路上花费的时间。
Donald Trump，美国房地产之王，特朗普集团的主席
据《每日新闻》报道,特朗普成功归功于他每天只睡三到四个小时以保持领先竞争对手
一步。
他似乎并不能理解，睡眠和成功可以共存，他在《每日新闻》里说:“一天睡12-14小时
的人如何能与每天睡3-4个小时的人竞争?”
Indra Nooyi，百事公司CEO
自2007年在百事公司任职以来，Nooyi成为了全世界最卓越的女性之... 阅读全帖 |
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a***s
发帖数: 12296 | 10 据台湾媒体报道，主持天后小S完美征服米兰时装周后，光荣返台，又为大家呈现她的新尝试，受邀拍大人物慈善摄影巡回展的排湾族手工织布造型今曝光，她低胸露小蛮腰又秀腿，首次穿上S型流线立体服装，能露的几乎都露，她表示满意如今身形“现在不会过瘦，该翘的地方都翘”，而且现在她人生态度越发轻松自在，“衣服只要美就好，不会绑手绑脚怕曝光”。
小S这回的服装带有祈福寓意，由来自台东的工艺师余仁玮和设计师安德烈，以排湾族织纹工艺技术中的公主纹、角边纹和石灶纹为设计概念，三者分别象征尊贵、圆满和希望。他们将手工织布结合硬质塑型度高的硬网，做出S型流线的立体服装，衬托小S的窈窕性感。小S也希望借此传送正能量，“台湾今年地震，最近身边又好多人身体不舒服，希望把力量献给所有人，祝大家健康平安”。
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j*****a
发帖数: 658 | 11 我觉得可以用RIPA + lowery assay or RIPA + BCA assay。 这两个assay，公司的说
明书上都说是detergent compatible的。 |
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S*****s
发帖数: 287 | 12 我用的老鼠大脑是以前取下来 fresh frozen 的。这样的脑子既可以用来切片也可以用
来提蛋白或者 RNA。如果你有新鲜的大脑效果应该更好。如果你只是用来提蛋白可以把
冻好的脑组织放在加了 protease inhibitor 的 RIPA 里面解冻，然后在 RIPA 里面
homogenize。你说的那个加液氮粉碎组织的我也做过，不过是把组织粉碎之后提 RNA
用的，那个还要用专门的冷冻好的 mortar pestal，蛋白不需要这么苛刻的条件。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 13 小弟刚从生化转到发育领域玩
目前正在做一个Homeodomain protein,查10年来的相关的发育领域的文献（DB,
development）非常奇怪地发现都只有in situ 检测蛋白表达和分布，没有免疫组化，
也没有western
我试了市面上所有commercial抗体，也都不能在组织里检测到（western 和免疫组化）
作为阳性对照，转293 overexpress的蛋白检测起来都是没问题的
PS ：我做组织裂解液是用RIPA+超声打散的办法（组织在RIPA buffer里沉淀后直接用
超声打匀，反复三次），理论上也应该没问题？
求指教！
另外还有一个好奇的地方：很多做发育的文章也都只用ｉｎ ｓｉｔｕ来说明问题，这
是什么原因呢？ 是因为组织里免疫检测不到很正常？
另外，没有蛋白水平的检测能说明问题么？ 比如可能蛋白质已经被truncate 了 ，或
者蛋白质aggregate了 ，或者被调控降解了 ，这些都是不能用简单的insitu来证明的
吧？ |
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w********r
发帖数: 1431 | 14 1.wash cell twice with PBS
2. incubate with DSP/DMSO/PBS solution for 20min at RT (freshly!!! prepared
DSP,2.5mg DSP-->480ul DMSO-->12ml PBS, final 200ug/ml DSP)
3. wash 2XPBS
4.incubate 5min with 50mM Glycine/PBS
5. wash with PBS
6. harvest cell in RIPA buffer with PIM, w/o DTT!!!， followed by CO-IP. Wash stringently with RIPA before WB.
Good luck! |
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s******s
发帖数: 13035 | 15 谁和你说在pellet里的？RIPA够强的话应该在上清，RIPA太弱的话倒是
可能，但是你的蛋白也很多溶不出来 |
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s*****o
发帖数: 26 | 16 是的，好像ripa buffer里面不要有EDTA。pierce ripa buffer可以用，Cell
signaling的有EDTA。你也可以自己配。
buffer |
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c****g
发帖数: 93 | 17 Maybe NP40 or charps is better for COIP of membrane proteins。
RIPA lysis buffer裂cells这一点上应该问题不大：我们的做法是加上RIPA，然后用
1ml针管+#7针头needle 10 times；最高速离心10min @4oC后去上清即可。 |
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w*********n
发帖数: 439 | 18 Chip拉下来的sample，
就是不该有TF结合的地方，却能做出PCR band.
你一般拿RIPA buffer洗几遍能洗干净？
如果你的没问题那就可能是我自己的问题，我重配Rich Young的RIPA buffer再试一下
，多谢指教~ |
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w******a
发帖数: 65 | 19 是全细胞裂解液（whole cell lysates）还是Triton extracts 或者RIPA extracts？
我的个人经验，如果是Triton sample （通常用于co-IP），有一种可能性是抽提不完
全，药物刺激F-actin增加导致这一部分的骨架蛋白不溶于Triton lysis buffer。但如
果是WCL或者RIPA sample就要考虑其他的原因。 |
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f*******d
发帖数: 92 | 20 Histone 是很容易做的，要sonicate cell lysates, 确保细胞核裂解，RIPA buffer绝
对没问题。如果没有的话，1% SDS ＋ heating也很容易看到，如果还看不到的话，用
8M UREA+RIPA, 这样的话，即使在胶上都能看到很强的band. 此外这个protein特别小
，好像15还是18kD, 所以胶别跑过了。 |
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发帖数: 1 | 21 我只是做过很多tail anchored protein，有一些经验。
我觉得你说的已经可以充分证明作用区域在TMD。如果现在设想的单纯用TMD的办法又表
达量很低，那么可以考虑swap TMD。就是找另一个在细胞膜上毫不相干的跨膜蛋白质，
挑它的TMD，就找中间20个非常疏水的AA应该没有问题，swap到你蛋白质里，然后做
CoIP。这个不相干的蛋白质作为negative control。这样可以保证你的蛋白质TMD外围
信号不变。
但是要提醒你，如果蛋白A和蛋白B都是跨膜蛋白，CoIP出来的结果可能是假阳性，特别
是你用的detergent只有NP40，并且negative control是cytoplasmic protein，比如
free GFP。那么AB会CoIP，negative control不会。因为NP40是弱detergent，我怀疑
membrane在buffer里被打成了micelle， 所以AB同在micelle里一起被IP。如果用RIPA
buffer你会发现AB不CoIP了，当然你也可以认为RIPA buffer太强了。所以除了CoIP最
好有其他证据证... 阅读全帖 |
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c***s
发帖数: 70028 | 22 麦当娜
美国当地时间8月16日，流行乐坛超级天后麦当娜（Madonna）迎来了57岁生日，尽管已经将近花甲之年，不过她体内流淌的野性却丝毫不减。在自己的57岁生日派对上，“永远18岁”的麦当娜就举办了一场疯狂的吉普赛派对，她的造型打扮也非常性感。
据报道，在57岁的生日派对上，麦当娜穿着一件长袖的透视上衣，里面搭配着一件黑色蕾丝的紧身胸衣，她的头上还戴着几朵鲜艳的大红花。
另外麦当娜的4个孩子都陪在她的身边，在她的生日蛋糕上，除了躺着一个衣着性感的奶油女郎外，而且还刻着代表她即将开始的世界巡回演唱会的“Rebel Heart”字样。
一些名人也出席了麦当娜的生日派对，这其中包括安迪·科恩（Andy Cohen）、凯莉·蕾帕（Kelly Ripa）和马克·康索洛斯（Mark Consuelos）。
新闻链接
受家暴离婚26年 麦当娜晒与前夫亲密亲吻照
麦当娜秀出数张珍藏的照片，其中赫然出现她与家暴前夫西恩潘的亲吻亲密照，让粉丝啧啧称奇。
据台湾媒体报道，近日，56岁的西洋流行乐天后“娜姐”麦当娜（Madonna）也赶潮流，秀出数张珍藏的照片，其中赫然出现她与家暴前夫西恩潘的亲吻亲密照，让... 阅读全帖 |
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s**x
发帖数: 266 | 23 第一个是大汉皇帝汉成帝刘骜
“牡丹花下死，做鬼也风流”，这是汉成帝刘骜风流一生的生动写照。刘骜自小喜爱读书，尤好文辞，宽博谨慎。做了皇帝后，日渐奢靡，沉湎玩乐。成帝刘骜好黑色，霄游宫装饰为黑色，宫人衣着服饰为黑色，尤其喜欢夜宴。他还发明了一种土飞机，美其名曰“飞行殿”。约一丈见方，其状若辇。傍晚时分，由高大威猛的羽林男儿肩负狂奔，刘骜端坐其中，但闻风雷之声不绝于耳，十分惬意。其时，刘骜宠爱班婕妤，相邀同乘。班婕妤是个贤德的美才女，不仅不愿同乘，还引经据典进行劝诫，刘骜十分扫兴。宫中玩腻了，刘骜便微服出游，常去宫外寻欢作乐。
鸿嘉元年，即公元前20年，刘骜在阳阿公主府上见到一位女子，腰弱身轻，舞姿袅娜，美艳绝伦，惹得刘骜心荡神驰，便将她带回宫里。这个绝代美人，就是赵飞燕。入宫后的赵飞燕为了更牢固地笼络住刘骜，还推荐自己的胞妹赵合德入宫，姐妹共侍成帝。赵合德姿容出色，肌肤雪嫩，温柔可人，刘骜一见倾心，将其怀抱命名为“温柔乡”，并感叹说：“吾老是乡矣，不能效武皇帝求白云乡也。”
赵飞燕姐妹入宫成为刘骜新宠后，便向许皇后、班婕妤二人发起进攻。班婕妤主动退避，向刘骜请求前往长信宫侍奉王太后，把自... 阅读全帖 |
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d******a
发帖数: 32122 | 24 “圣主”康熙真面目：好色伪君子，纳姑母为妃
2008-08-19 08:59:33 来源: 网易社区 网友评论 265 条 点击查看
康熙有正史记载的老婆55个。其中有一个良妃卫氏，是汉族包衣，在浣衣局被康熙
给瞄上了，这个良妃“美艳冠一个宫，宠幸无比”，而且“体有异香，洗之不去”。
清朝的康熙皇帝历来史家对他的生平事功、历史地位都有很高的评价，康熙皇帝自己也
仿佛以理想儒家帝王而自我标榜,然而最近的研究发现真实情形却并非如此。
满族本是关外的游牧民族，入关前尚处于奴隶社会的晚期，风俗野蛮并未开化。然而，
风俗习惯的改变并非是一天两天的事情。譬如爱新觉罗·皇太极，先是娶了自己姑姑博
尔济锦氏，生了三个女儿；接着又娶了博尔济锦氏年仅十三岁的侄女，后被封为庄妃，
生了顺治帝福临和三个女儿；后来还娶了博尔济锦氏另一个二十六岁的侄女，也就是庄
妃的亲姐姐，生过一个两岁即夭的儿子。
素有圣主明君美誉的康熙，私生活竟如此淫秽放荡？
在皇太极死后就发生了孝庄太后下嫁摄政王“多尔衮盗嫂”的事件，而当时满洲皇族视
之为满洲习俗理所当然，并不为耻。再如清代皇帝祭神有吃生肉和跳萨满(一种原始的
巫婆舞蹈)的... 阅读全帖 |
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s***q
发帖数: 10585 | 25 中国女人朝着美国商学院蜂涌而至
For Chinese Women, U.S. MBAs Are All the Rage
http://www.businessweek.com/print/bschools/content/may2011/bs20
htm
For Chinese Women, U.S. MBAs Are All the Rage
Seeking an edge in the job market, Chinese women are flocking to U.S. B-
schools—enough to boost female enrollment overall
By Alison Damast
(Corrects name of company where Crystal Ma will be interning this summer.)
Gail Hu first considered an MBA degree in the U.S. while a student at Fudan
University in Shanghai. After thr... 阅读全帖 |
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b**********5
发帖数: 7881 | 26 觉得真是好笑。。 那些女人， 他妈的还是一如既往的不是人
1） 一个女的， 好像老公开车去世了。 然后又是捐款搞出来的一通渣人。。。 有的
人说， 你既然要捐款， 就要公开你的财产。。。 我的天啊， 你他妈的高兴捐， 就
捐， 不高兴捐， 就不捐。。 他妈的屁放的比我儿子还多还臭！ 还有人说， 什么活
着是最大的幸福， 不应该捐。。 我也彻底服了那些bitches
2） 然后还有那个国内女司机被打的事。。。 竟然还有一群人觉得应该。。 不， 竟
然还有一群女人觉得应该。。 那些bitches， vagina都被操烂了么？？！！！男人打
女人， 还他妈的认为女的应该被打？？！ 这都他妈的什么封建思想？？！！不管那个
女的怎么cut him off，男的打女人， 就是不对。。。
这些华人上的女的， 来了美国后， 学到了LV， coach， jimmy choo， 难道就没听说
过a man should never lay his hand on a woman 么？？！ 想当年， 那个american
idol的一个gay 男， cohosting the morning talksho... 阅读全帖 |
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L******t
发帖数: 1985 | 27 WSJ Study Finds Asians Occupying Few Corner Offices
Despite an outsized share of Ivy League degrees, Asian-Americans are
underrepresented in executive suites, according to a study expected to be
released Monday.
Roughly 5% of U.S. residents identify themselves as Asian, but less than 2%
of executive roles at Fortune 500 companies are held by Asian-American
professionals, according to the report from the Center for Work-Life Policy,
a New York-based nonprofit think tank.
Only eight Asian professi... 阅读全帖 |
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d****z
发帖数: 9761 | 28 不是头一次多了，不光Larry King的，他还替过Regis Philbin跟Kelly Ripa搭档N次 |
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g*********d
发帖数: 233 | 29 http://online.wsj.com/article/SB1000142405311190423340457646204
亚裔美国人：高学历为何没有高职位
一份周一发布的调查报告显示，亚裔美国人拥有常春藤盟校学位的比例较大，但当上公
司高管的比例低于其他族裔。
纽约非盈利智库工作-生活政策中心(Center for Work-Life Policy)一份报告显示，大
约5%的美国居民将自己认定为亚裔，但财富500强公司管理职位中，由亚裔美国人士担
任的不到2%。
只有八位亚裔人士目前为财富500强公司一把手，其中包括花旗集团(Citigroup Inc.)
的潘伟迪(Vikram Pandit)和雅芳(Avon Products Inc.)的钟彬娴(Andrea Jung)。但亚
裔常常是拿着很多人梦寐以求的文凭进入职场的。据全国教育统计中心(National
Center for Education Statistics)数据，亚洲人和亚裔美国人占常春藤盟校本科生的
16%，占加州大学伯克林分校(University of California at Berkeley)、麻省理... 阅读全帖 |
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B********e
发帖数: 19317 | 30 The LOWEST Box-Office Take Of All Time
Posted December 16, 2008 - By Joseph Baxter
History was made last weekend at the box-office: Worst opening for a major
film...EVER. (For "Very Wide" releases of 2,000+ theaters.)
Above is the trailer for an animated feature called Delgo. It is the end
result of a $40 million dollar investment, nearly 7 years of hard work from
an independent Atlanta-based animation studio called Fathom, and a somewhat
impressive cast of voice actors that includes Malcolm McD... 阅读全帖 |
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s****u
发帖数: 483 | 31 elisa本质上就是多孔western
如果在RIPA里面ab ag反应失效您能做出western么？不要胡思乱想拉 |
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v*********i
发帖数: 40 | 32 全细胞蛋白做WB。
以前我是这样做的：
转染之后，6 cm 板（5×10^6)直接拿200 ul PBS冲下来，加过量的5 × SDS PAGE
loading buffer （我一般加80 ul），95度煮30 min；然后 13000 rpm 离心 10 min。
基本看不到沉淀。
然后取10 ul 跑胶WB；因为转染起始细胞数目一样，所以基本不调平，看到的beta-
actin就是平的。
现在的老板说我这样做不对，因为没有测蛋白浓度。他要看到我把每个样品的浓度都写
到本子上；还说直接煮不能溶解全部的蛋白（FT）。他很固执，我只好按他的做：
转染之后，6 cm 板用RIPA buffer 800 ul, 加那个Roche Cocktail蛋白酶抑制剂， 冰
上放30 min，然后 13000 rpm 离心 10 min，结果看到大量沉淀。我感觉沉淀跟直接低
速离心收细胞的沉淀差不多。是不是细胞都没破裂啊?
哎，连个成熟的protocol都木有……
谁能给我个完整成熟可靠的呀?说的详细点。
谢谢。
p.s.
我不放心，现在把那个裂解液又拿去超声了；可是超声仪太古老，上面没有能量显示… |
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q******g
发帖数: 3858 | 33 RIPA buffer是比较强的裂解液，容易使细胞核裂解，染色体DNA出来。超声后，DNA断
裂，就看不到那些沉淀了。 |
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v*********i
发帖数: 40 | 34 是的耶。其实根据原理自己也能判断我的做法应该没问题；而且以前、别人都是这么做
的。
我郁闷的是老板说我这么做不对，还指责我，还说你要是不会做就问问其他人，看看人
家是怎么做的。可是我明明会做，而且做的是对的。
所以想发上来让大家评评理。
我直接加SDS PAGE loading buffer到PBS悬起来的细胞里面煮，老板一听就说怎么能这
么做，你这么做是错的……不能用SDS loading buffer，这个是跑胶的时候上样用的，
你提细胞里的蛋白得用RIPA buffer。
还说，你怎么不加蛋白酶抑制剂。我解释说里面有高浓度的SDS，再煮过，不需要加蛋
白酶抑制剂了，因为蛋白酶已经变性了呀（我的解释对不对??????）
可是老板说做蛋白都得加蛋白酶抑制剂，你不是说自己以前做过很多蛋白质实验吗，你
要是没做过就说没做过，我可以让其他人教你，你要是不知道怎么做，要主动问别人，
看看人家怎么做的，等等。
还说，你怎么不测蛋白浓度；我就解释说我觉得不需要测蛋白浓度，以前我都不测，因
为转染的时候起始细胞数量是一样的，蛋白量应该差不多，加actin内参看一看就应该
知道平不平了；另外加了SD |
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j*****a
发帖数: 658 | 35 1。 proteinase inhibitor cocktail and phosphatase inhibitors 是要加的。他们
的作用是防止你在抽提蛋白的过程中蛋白讲解。在你一开始用pbs悬细胞的时候，如果
不加这两种抑制剂，会有蛋白降解。一般我洗细胞的时候就开始加。当然蛋白煮过变性
就不存在这个问题了。
2。 你的方法当然是可行的。5x sds page loading buffer 里就有detergent SDS，然
后再加热裂解，当然没错。如果你对自己的手平行操作非常confident，是完全可以不
测蛋白浓度的，直接加热完后run gel。 其实测蛋白的时候如果做的好一般情况下，
sample和sample之间浓度都是差不多的，校正和不校正是没有很大差的。所以你的做法
没有啥不对。只是你老板的做法是小学生式的，step by step, 也是classic的做法。
3. RIPA buffer是很强的裂解液，里面有几种detergent 组合，所以一般情况下裂解是
很完全的。就像上面的人说的，超声主要是打碎DNA，有点牛刀杀鸡了。
4。关于loading contro |
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h**2
发帖数: 2841 | 36 老弟/老妹，很多实验室都有自己的习惯，尤其是你做phd的话人家assume你是张白纸，
谦虚小心点follow他们的习惯总不会错。
虽然你的这个实验beta actin是匀的，但对于你的这个方法对establish自己的实验系
统很不好。
首先以后你可能会碰到细胞数在transfection/infection之后变化很多，其次你用pbs
冲下来的话也可能漏掉一些，这些都是很可能的，实验多了的话难免出错，但你最快也
要等到running/transferring之后用ponceau S才能知道，浪费时间啊。至于裂解的话
找个标准的protocol用RIPA来做吧，算是经典方法之一，不想配的话公司有卖的。记得
加上protease inhibitor和phoshpatase inhibitor (thermo)也有卖的
我老板平时都不管学生，但每个新生进实验室一般迟早都会被骂一次，算是整个phd培
养过程唯一一次micro-management，常常会说it's scientific research, not
cooking!开始也有点不服气，但后来慢慢意识到每一步仔细一点，其实整体上 |
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h**2
发帖数: 2841 | 37 我们的实验一般细胞都不能太confluent，一般65~90%吧
WCE protein concentration如果用100 ul的RIPA的话有1~2 ug/ul，不过这个跟我们的
spectrometer有关，我们一般1:400 dilute，终浓度太稀的话reading unreliable
Loading的蛋白量的话就根据看什么了，一些oncogene或者tumor suppressor的话我喜
欢10~30 ug，不过30 ug WCE的actin 1:10k，20 min还是太深了，我有时候用tubulin 1:10k，15 min好一点
BioRad的那套东西，15-tooth standard comb的话max应该是55 ul, 10-tooth好像可以
load 80 ul吧？ |
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z****z
发帖数: 42 | 38 一般用RIPA
你说的现象正常，autophagsome多的时候，本身对LC-3II的降解很厉害，所以western
看不出来这个趋势，后来少的时候自噬能力减弱，反而能看见了。
真正体现的自噬流还得加抑制剂，试一下3-MA。
超声貌似没有必要，可以裂解时间长一点，加蛋白酶抑制剂，用小号的枪不断吹。
Good luck. |
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t*x
发帖数: 1065 | 39 呵呵，谢谢详细的回复！
那我就用RIPA buffer试一下
不过像你说的，如果这种现象正常的话，估计换了buffer也应该差不多的趋势。:)
刚开始的时候没有用sonication，只是0.5%triton X-100 30min 冰浴裂解
后来听别人建议，加了sonication,发现跑完westernblot，结果很一致，都是处理12小
时之后，在镜下观察发现vacuole都消失差不多了，才看到lc-3II的增加
呵呵，我以为是开始时lc3-II在vacuole膜上镶嵌，没有裂解下来，而时间长了
autophagosome跟lysosome结合吞噬，lc-3II被从膜上释放出来，成为cytosolic形式才
能被我检测到呢，所以一直在找比较强的裂解膜上蛋白的方法。
你这样说，我就比较放心了，恩，非常感谢！
western |
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S*****s
发帖数: 287 | 40 我用 15ml RIPA/1mg 脑组织，用 mortar 打碎，离心之后取上清，蛋白浓度一般在
4mg/ml 左右 (Bio-Rad Bradford assay)，做 western 检测膜蛋白效果不错，过程也
蛮简单。 |
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N***P
发帖数: 153 | 41 260mg眼球组织（玻璃体，虹膜，视网膜，睫状体--除了巩膜角膜，其他能取的，都去
了）
按照Abcam的western blot protocol,5mg加300ul,这也太多了吧。而且晶状体里面大部
分是水。 |
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f******k
发帖数: 856 | 42 5mg加300ul，那260mg要很多了，要我做的话，我可能会加500ul。只是我的意见啊，仅
供参考 |
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c******e
发帖数: 94 | 44 用acetone沉淀蛋白后怎么样可以让尽量多的蛋白重溶，用的是Ripa buffer。我试过2
次，不管是加热还是超声，
总还是有很多沉淀物化不了。有什么trick没有，谢谢 |
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W****C
发帖数: 1937 | 45 invitro系统的蛋白浓度有100mg/ml 做IP的话用ripa稀释？ |
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S*******m
发帖数: 34 | 46 可以试试先用适量的RIPA buffer提取蛋白，然后13000rpm离心，取上清。
是很
protein |
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r*****m
发帖数: 231 | 48 自己配！
不work再来问。。。
你要连你这些buffer里面有些什么东西都不知道，别人怎么解答你的问题呢？ |
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j*****a
发帖数: 658 | 49 what lysis buffer did you use? I am wondering if RIPA buffer/denature buffer
is okay for IP......
Do you know anything about this? THanks!
western |
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j*****a
发帖数: 658 | 50 Don't quite understand your question.... You want to detect the
phosphorylation of a protein, why not use western? Even if you do ELISA to
see p-protein, no need to sonicate....RIPA is strong enough to get all your
cytosolic and nuclear protein out. Sonication mostly is used to break down
chromatin, DNA or chop down plasma membrane to release cytoplasma membrane
protein....If I am wrong, please someone corrects me.. So I think in your
case, you probably don't need sonication at all.
Also, freez... 阅读全帖 |
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