C*******e
发帖数: 4348 | 1 hoho，我这两天做的也是基于pUC19的
是pUC19(SacI)-(SacI)fragment I(XmaI)-(XmaI)fragment II(BamHI)-(BamHI)
fragment III(XbaI)-(XbaI)fragmentIV(HindIII)-pUC19(HindIII)
每个fragment大概0.8-1.1kb
然后我做的是pUC19 50 ng,
pUC19:f1:f2:f3:f4=1:5:5:5
总体积15-20 ul
ligate 20 hrs
然后3 ul加到一管TOP10电感化态细胞里
涂100-200 ul/平板
然后挑克隆
用colony digestion筛选
一起做了五个ligation
一天筛了近90个克隆
每个ligation都筛出正确的了
然后这些positive的提质粒出来
用不同的酶切再确认一下
然后测个序（或者不测）
直接PCR的切就行
不过我个人比较喜欢的是每个片段先做到TOPO里面（pBluntII)
先测序
挑序列正确的再酶切、胶纯化，往下做
这样每一步都是正确的序列
最后终产物酶切什么都对的话不测序也没关系
不然如果... 阅读全帖 |
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h**********r
发帖数: 671 | 2 在此拜过克隆达人，跪求葵花宝典。
我正好有个克隆要做，就是teminator-promoter-ORF-terminator.
一看酶切位点设计的正好是：
pUC19 (HindIII)-(HindIII)terminator(PstI)- (PstI)promoter (XbaI)- (XbaI)ORF(
KpnI)-(KpnI)terminator(EcoRI)- pUC19 (EcoRI)
片段都不大。
请问葡萄MM，我这个能crazy一把吗？我做克隆也是身经百战了。
直接切PCR产物就OK了吧？
多谢！
实验成功，必有包子酬谢！ |
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发帖数: 1 | 3 1 北京大学生命科学学院魏文胜课题组
我们使用了文章中报道的高效ssDNA，同时自己设计了其他2条针对体内其他基因位点的
ssDNA，与NgAgo表达质粒共转HEK293T细胞与HeLa细胞，2天及5天后，用T7E1检测切割
效率，这三条针对2个不同基因的ssDNA，在HEK293T和HeLa两个细胞系中，无论转染一
次还是在8到12小时后再转染一次ssDNA，都没有检测到切割。
针对敲除后能使细胞有表型变化的某特定基因，我们设计了ssDNA，与NgAgo表达质粒共
转HeLa细胞5天后，发现细胞表现出了一定的对应表型，但是把这部分细胞收集起来提
取基因组，对靶位点测序，没有发现基因组序列的任何改变。
我们针对某特定基因设计了6种ssDNA，用特异的荧光报告系统检测是否有靶点DSB产生
，结果显示所有实验组均没有检测到对靶位点DNA序列的切割活性。
2 中科院动物研究所王皓毅课题组
我们在293T细胞中表达带有Flag标签的NgAgo ，在不同时间点检测NgAgo蛋白表达。发
现转染6小时后开始检测到目的蛋白，随着时间的延长蛋白量增加。在人类293T细胞系
中重复原文章中Figure ... 阅读全帖 |
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N*o
发帖数: 97 | 4 try stb12 bacteria (grown at 30C); try promoter-less plasmid (pUC18, pUC19).
Or try keeping the insert in two plasmids (e.g. 2kb in one, 3kb in the
other) while cloning and finally ligate the two. good luck! |
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a****o
发帖数: 1786 | 5 There is usually Pvu II and Sca I site in the backbone of vectors. Many
vectors were from pBR322 or pUC19. |
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b******n
发帖数: 4225 | 6 呵呵，省点钱不容易
得花精力进去
对了，你用的什么backbone，pUC19? |
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r******y
发帖数: 21907 | 7 如果两个construct来源不同，能反应吗？比如一个是gateway system，一个是一pUC19
为Backbone的需要连接克隆的，两个分别带有N-YFP和C-YFP，这样转化后可能出结果么
？觉得不可能。 |
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b******s
发帖数: 1089 | 8 只要能表达，理论上应该都可以吧。不过好像half YFP有不同的大小，大部分是从大约
150几个aa处断开，也有从174aa处断开（这种据说效率更好）。不同来源的片段应当检
查一下sequence。
pUC19 |
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g*********3
发帖数: 177 | 9 大家好。
最近一段时间在挣扎gateway LR reaction:
用的是pLXSH gateway 作为destination ector
用的另一个entry ector含有attL1 ATTL2
所用的质粒测序无误含有recombination site。
用的是invitrogen的LR cronase enzyme mix II.
pLXSH is resistant to Amp and After LR reaction, I do transformation. I didn
't get any colony. [Zero.]
Entry vector is amp resistant too. So I cut the amp out and linearize this
vector.
I also do LR reaction with plxsh + Gus. Gus is positive control entry vector
provided by the kit.
There is no colony.
I have done positive p... 阅读全帖 |
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