j******1
发帖数: 1315 | 1 谢谢dsamyu的回复，您用过pTripz了吗？如果可以的话，它们网站上说的其实是pTripz
(和2nd match)和3rd不match.太狡猾了。 |
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m**********d
发帖数: 137 | 2 用pTRIPZ lentivirus建立起来的细胞系，稳定表达某doxycycline-inducible shRNA。
在in vitro测试phenotype很稳定
现在要把细胞在tet-off的状态打到裸鼠体内，等tumor长起来，再开始给doxycycline
以及相应的treatment。现在的问题是，doxy该怎么给，文献上很多都用doxycycline
drinking water，可我听说doxycycline可能会precipitate，很难控制老鼠喝进去的量
；还有人用doxycycline的食物，但似乎也不大好控制doxy的量。
不知是否有人用过oral gavage，似乎这样可以准确地定量doxy，隔天通过gavage给
doxy不知是否可行？
请问版哪位曾在in vivo试过pTRIPZ这个系统，它的doxy-inducible knockdown
efficiency和leakiness不知道还不好
谢谢 |
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T**********r
发帖数: 287 | 3
inducible
多谢提醒，不过你提到这个是openbiosystem的另外一个系统TRIPZ，的确是用
tetracyline
induce的。
Open biosystem有两种shRNAmir系统实现knock down:
a.Stable knockdown: GIPZ；shRNAmir is constitutively expressed as a
polycistronicvector that codes for tGFP, puromycin resistance
marker (Puror) and the shRNAmir.
b.Regulated knockdown: pTRIPZ,也是你提到的。
见链接
http://www.openbiosystems.com/collateral/rnai/pi/Lentiviral%20shRNAmir%2
0for%20Stable%20and%20Regulatable%20RNAi.pdf
再次真诚感谢，有了质疑，才能避免将来实验走弯路。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 4 天然的miRNA也有很多同时表达的吧，
你可以模拟他那个结构，用pTRIPZ来表达。
sorry,没有做过lenti， 不熟悉有哪些vector可以用。有没有哪个lentiviral vector
可以同时表达两个不同的shRNA，并且有荧光marker做FACS啊？ |
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i*****i
发帖数: 154 | 5 包装入病毒的是3LTR和5LTR之间，含有packaging sequence的那一段，除此之外的序列
是不会包进病毒的，例如神马氨苄抗性基因，puc ori等东西。所以计算的时候要扣除
这些东西。整个质粒10kb，包装的RNA估计8K左右（去掉2k的零碎）。所以应该没有什
么问题。Open biosystem的pTripz shRNA的质粒有13K，照样包装。 |
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j******1
发帖数: 1315 | 6 才知道和Third Generation的package system不match，大家有什么办法吗？谢谢回复 |
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z*******t
发帖数: 21 | 9 我也用的是pTRIPZ，In-vivo用的是水加Dox。配方如下：
0.5gDox溶于23mL 50% 蔗糖溶液中，注入230mL（8OZ)袋装水中。终浓度：Dox，2mg/mL
，蔗糖，5%。水上盖锡箔纸避光，一周一换。
用qPCR可以检测到RFP表达，说明此浓度可用。
试过注射和灌胃。灌胃伤害太大，腹腔注射好像导致了腹水，原因不明。也试过食物（
找别人借的），老鼠不太爱吃，不过效果不错，也可以诱导RFP表达，只是太贵，好像
一买就是一个大包装，我用不了那么多，后来就一直用水了。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 10 楼主，请问你用pTRIPZ lentivirus建立起来的细胞系是怎么操作的？
细胞染毒后稀释传代加药挑单克隆？还是只是加药筛选后pool所有的存活细胞？ |
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m**********d
发帖数: 137 | 11 多谢楼上几位的热心回复！
我所用的细胞已经带有一个puromycin resistant的luciferase construct了，因此在
病毒infection之后没有办法再用puromycin筛选，幸好pTRIPZ vector有RFP，我用FASC
sorting拿到的细胞pool |
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c*******4
发帖数: 154 | 12 对于cancer领域来说，这是一个非常不错的原始数据，值得跟进。如上所说，你必须验
证这个现象。我觉得最好的办法是能搞到inducible的shRNA，看看open biosystem的网
站，他们有pTRIPZ一类的inducible的shRNA。 |
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c*******7
发帖数: 314 | 13 tet on的可以用obs的pTRIPZ，有荧光，XhoI、EcoRI clone很好用，最好design 3‘
mismatch。pGIPTZ没用过，可以打电话问 |
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