h******u
发帖数: 602 | 1 检测一单链DNA是否形成HAIRPIN， 是不是Nuclease S1就是做好的方法了？初步打算用
Cy3-label 5'end，然后用Nuclease S1处理，如果形成HAIRPIN的话，LOOP就会被降解
，产物RUN PAGE GEL。
从来没用过Nuclease S1,有啥要注意的吗？谢谢了！ |
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i******w
发帖数: 407 | 2 用的是Qproteome Bacterial Protein Prep Kit，里面有Benzonase Nuclease，结果跑
SDS-PAGE然后coomassie染色后，总在最下面几kb左右出现一条超蓝的带。
直接用cell culture加laemmli buffer跑就没有那条带。所以我猜应该是Nuclease。
请问一下谁知道怎么能把protein extract里的Nuclease去掉啊？谢谢 |
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a***e
发帖数: 1010 | 3 It is targeted.
However, there is also a concern of specificity and the available zinc
nucleases are also not unlimited. |
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j*b
发帖数: 341 | 4 Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs
using zinc-finger nucleases"
Nature Biotechnology, August 13, 2009 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 7 RE:
adeno (天夺其魄) 的post:
不是吧,
Jennifer A. Doudna HHMI
UC Berkeley组 &瑞典于默奥大的 Charpentier组的 manuscript 被 Sci magazine
accepted for publication
2012 summer n天后的
conference 上 Emma Charpentier (she) will like to note it, isn't it?
Feng Zhang 的2013 Sci magazine paper adeno (天夺其魄) 您看了全文后
看了全部references 它们的whole abstract parts 了吗?
pls refer
Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems
Science. (2013) 339: 819-23.
by
Le Cong F. et al. and Feng Zhang
web link:
>HTTP://www.ncbi.nlm.nih... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 8 RE:
adeno (天夺其魄) 的post:
不是吧,
Jennifer A. Doudna HHMI
UC Berkeley组 &瑞典于默奥大的 Charpentier组的 manuscript 被 Sci magazine
accepted for publication
2012 summer n天后的
conference 上 Emma Charpentier (she) will like to note it, isn't it?
Feng Zhang 的2013 Sci magazine paper adeno (天夺其魄) 您看了全文后
看了全部references 它们的whole abstract parts 了吗?
pls refer
Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems
Science. (2013) 339: 819-23.
by
Le Cong F. et al. and Feng Zhang
web link:
>HTTP://www.ncbi.nlm.nih... 阅读全帖 |
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b******k
发帖数: 2321 | 9 这个有paper么？我记得ZFN有，TALEN和crispr还没有吧？
话说我曾经的一个想法是ZF/TALE后面接recombinase, transposase,或者别的啥酶替代
nuclease，这样也许可以提高KI的效率。最近1年没怎么跟这方面的工作了，不知道有
没有类似的办法出来 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 10 if that PCR mutation coincidencely happend on the key ponit or region of the
binding sites between that
probe and Genomic DNA sample, which is simialr to loss of docking site in
Western Blotting , then how can you expect both bind tightly unless p32 or
s35 etc isotope labelling can pick weak binging up but Dig labelling Can't
pick that kind of weak binging.
And after sub cloning that the slected white clone can keep your probe
almost no changed and inserted into that vector with LacZ gene of β-
... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 11 cited,
>Both zinc finger nucleases (ZFNs) and TAL effector nucleases (TALENs)
>can be used to mutagenize genomes at specific loci, but
these systems require two different DNA binding proteins
flanking a sequence of interest, each with a C-terminal
FokI nuclease module. As a result these methods have not
been widely adopted by the plant research community.
from
>Belhaj K et al., (2013).
>Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop
plants using the CRISPR/Cas >system.
>P... 阅读全帖 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 13 this is right.
I believe Millipore water is nuclease free.but make sure you use nuclease-
free container for the water. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 14 RE LZ
Did you read that Oxford nanopare NGS any relative paper? then replied with
below sentence?
1)
Nanopore 在
测长的DNA 上面有优势，号称没有 read length 的上限
2)
nanopore不用nuclease切DNA啊，你在哪里看到的。文章里明确说了，测完后还能
recover DNA的。它这个理论上就是靠DNA不同的碱基和那个pore蛋白的物理互作测序，
可能是氢键吧
3)
but now still has assembly problem
[ 47 ]
发信人: yuem0428 (ym), 信区: Biology
标 题: Re: 测序技术的重磅炸弹--Oxford Nanopore
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Feb 22 17:43:13 2012, 美东)
I would say there are two problems.
1. IT support. All previous sequencing data are from ... 阅读全帖 |
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d*********e
发帖数: 18 | 15 最近纯化的一个蛋白中总是混有nuclease，已经尝试了用高盐高甘油的GF buffer （2M
NaCl, 10% glycerol）以及阳离子交换柱。听说加actin或者用Aurintricarboxylic
acid有些效果，但是不知道加多少。求教有没有什么好的方法能去掉或者抑制nuclease
活性？谢谢！ |
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s*****g
发帖数: 87 | 16 Reprod Fertil Dev. 2012 Dec;25(1):312. doi: 10.1071/RDv25n1Ab328.
328 versatile transcription activator-like effector nuclease (talen)-
mediated engineering of ossabaw miniature Swine.
Carlson DF, Tan W, Fahrenkrug SC.
----------------------------------------------------------
Reprod Fertil Dev. 2012 Dec;25(1):316. doi: 10.1071/RDv25n1Ab337.
337 nonmeiotic introgression of quantitative trait nucleotides and
correction of congenital mutations in livestock with transcription activator
-like effect... 阅读全帖 |
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a******n
发帖数: 392 | 17 Nuclease残留是个可能的原因, 但是用southern作筛选克隆的时候，都是用粗提的
genomic DNA的，就是用proteinase K处理过夜，然后异丙醇沉淀。怎么尽量除去
nuclease呢？ |
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g****0
发帖数: 425 | 18 Can I get the abstract as well?
How do you comment on this report?
Nucleic Acids Res. 2013 Mar 1;41(5):e63. doi: 10.1093/nar/gks1446. Epub 2012
Dec 28.
Differential integrity of TALE nuclease genes following adenoviral and
lentiviral vector gene transfer into human cells.
Holkers M, Maggio I, Liu J, Janssen JM, Miselli F, Mussolino C, Recchia A,
Cathomen T, Gonçalves MA.
Source
Department of Molecular Cell Biology, Leiden University Medical Center,
Eithovenweg 20, 2333 ZC Leiden, The Nether... 阅读全帖 |
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a******a
发帖数: 283 | 19 我做了一些，水解细胞，溶液直接加入pcr系统去。结果发现出现的都是假阳性信号。
当然我是读取taqman荧光信号来衡量pcr结果的，不是跑胶。
解释是，nucleases直接切掉probe上的fluorophores，所以出现的荧光信号都是假阳性。
那么对我来说，我这个系统（依靠读取荧光信号来判断pcr结果的）就最好先加tris
buffer和proteanse K来除掉nucleases，再水煮一下样品灭火protease K或者其他的酶
。之后加入PCR系统。
看看怎么样，这个方案可好？ |
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w*********g
发帖数: 30882 | 20 笔者对此发表以下看法：
（1）卫生部2007年颁布实施《新资源食品管理办法》有意取消了2002年颁布实施
的《转基因食品卫生管理办法》“第五条 转基因食品的食用安全性和营养质量不得低
于对应的原有食品”这个条款，是退步，而不是进步！这种删除的实质是，进一步顺从
邪恶孟山都为首跨国转基因产业的私利与压力，置中国人民持续安全、健康、生存与繁
衍于不顾！
（2）卫生部2007年颁布实施《新资源食品管理办法》有意取消了2002年颁布实施
的《转基因食品卫生管理办法》“第五条”，但是卫生部《新资源食品管理办法》“第
三条”规定：
第三条 新资源食品应当符合《食品卫生法》及有关法规、规章、标准的规定，对
人体不得产生任何急性、亚急性、慢性或其他潜在性健康危害。
依据该第三条规定，在对于抗草甘膦转基因大豆加工的转基因大豆油，检测出超过
俄罗斯对大豆油草甘膦残留量允许标准与中国卫生部对棉籽油草甘膦残留最高限量2.9-
6倍的草甘膦残留量，已经证实对人类健康，特别对青少年、儿童、婴儿与孕妇及其胎
儿，造成极其严重危害情况下，（1）对人类健康不是形成 “潜在性健康危害”而是... 阅读全帖 |
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h*****G
发帖数: 113 | 21 本人生物千老一名，也算是搞基因编辑的。
就这次人类胚胎编辑而言，技术并无突破之处，科学上也无新意，而带来的风险却难以
避免。
本人曾经在2017年cold spring harbor的一个会议听过贺建奎的报告， 主要讲他在猴
子胚胎基因编辑的工作。在提问的环节，他基本上听不懂别人问的问题，我当时以为他
是英语不好，听不懂问题，现在看来他基因编辑的目的是卖他的DNA 测序仪，具体他做
的工作有什么生物学意义，他应该不是听不懂英语，而是真的不知道自己在做什么。
这次事件，艾滋病应该只是他的噱头，他的目的就是要搞个大新闻，然后卖他的测序仪。
基因编辑事实上已经研究很长时间了，一开始利用DNA重组，这个在老鼠里还得了Nobel
奖 (2007年，Mario R. Capecchi, Martin J. Evans and Oliver Smithies）.但是这
种方法效率很低，重组模板的设计也花时间。后来MSKCC的maria Jasin等发现如果把
DNA弄断 （cut），这时候DNA为了修复，就会利用外源的模板来修复，这样能极大地提
高重组也就是编辑的效率。之后大量的工作就是找能特异性打... 阅读全帖 |
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m***a
发帖数: 13878 | 22 近日，韩春雨在预印本网站BioRxiv上发表了一篇关于基因编辑的新文章：Background
free tracking of single RNA in living cells using catalytically inactive
CasE。
文章共有5名作者，依次为Feng Gao, Yue Sun, Feng Jiang, Xiaoyue Bai, Chunyu
Han，工作单位均为河北科技大学基因编辑研究中心。其中，韩春雨为通讯作者。
文章摘要和内容显示，RNA具有重要且多样的功能，将活细胞中分离的RNA可视化，将为
人们提供关于其作用的基本信息。迄今为止，科学家发明了两种活体RNA成像系统。
本项研究发现，CasE可被设计成RNA跟踪工具。这种工具被称为“VN-dCasE-VC”，效果
和可用性更强。
一位接近韩春雨的人士向《中国科学报》表示：“这篇文章是此前韩春雨工作的延续，
目的都是开发基因编辑工具。”
通常，首发在未经同行评议的预印本上，是为了获得首发权。
“韩春雨下一步还会投正式 期刊的。”前述人士推测。
新闻回顾
2016年5月，《自然—生物技术》发表韩春雨团... 阅读全帖 |
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S***J
发帖数: 1210 | 23 云老师发了个贴说清华目前的找人标准，很多人不相信。特地调研了一下清华生命学院
最近回去的人的情况，如云老师所说，绝大多数都有2cns，如果只有一篇cns，那基本
上还有>2的子刊。这个不仅仅局限于胖老师经常说的结构生物学，而是所有方向都基本
如此。
当然这些新回去的绝大部分都是千青（有些不是的是因为回去那一年千青还没开始）。
网页上的Title有的是教授，有的是研究员，估计当时还没有统一。但校内一律都是副
教授，也就是相当于这边的AP。我还特地打听了一下，国内的TT制度好像没有Tenured
Associate这一档，清华5年考核通过了就是正经的full professor。
有些老师看不上国内的科研，我就仅列出两位回国后的publication，咱就不说颜宁等
这种Early T的个例了。说两个没太有名气的，还没有评上T的，各位老师可以参考一下
，看看自己有没有别人这么productive。
一. Guangshuo Ou （11年回国，千青）
Select item 25342559
1.CYLD mediates ciliogenesis in multiple organs b... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 24 http://science.sciencemag.org/content/351/6280/1405.1.full
昨天刚刚在Science 登出来的内容，NIH 的领导以及各机构director 合写了一篇文章
，声明NIH一向支持基础研究从来没有变改过，并把CRISPR 技术的进展作为一个基础研
究成功的例子。说他们注意到了很多所里的基础研究项目明显的减少了。但是他们坚持
说这些减少是因为往那些所投的基础研究项目变少了。他们为了鼓励纯基础研究，准备
简化一些文档，不再强迫研究者们写他们的研究到底和public health 有什么直接关系
。
但是他们没有明说的一点是，投入基础研究的资金会不会改变。
以下是全文：
Basic science: Bedrock of progress
Almost 4 years ago, one of us (F.S.C.) wrote an Editorial (1) affirming the
continued importance of basic research to the National Institutes of Health... 阅读全帖 |
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c******9
发帖数: 8 | 25 安特诺生物医药（厦门）有限公司是厦门市第三批“双百”创业、创新领军人才、
外籍归国博士于2012年12月成立的中外合资公司，落户于厦门火炬创业园。公司主要从
事肿瘤监测和免疫治疗相关的实验和临床研究，提供从美国引进的专用于评价肿瘤治疗
效果与转移程度的“循环肿瘤细胞检测”服务，是一家集科研与检测服务于一体的生物
高科技公司。公司核心研发科学家和管理人员均为生物医药领域具有几十年工作经验且
具行业权威性人物。
2013年底，因公司发展需要，整体搬迁至厦门火炬（翔安）产业区，并投资新建了
国家级标准化的GMP实验室。
目前，公司与厦门大学药学院转化中心建立了项目合作关系，成立了厦门大学药学
院安特诺细胞医药研发中心，并与多家三甲医院开展临床科研与应用研究。
公司正处于全力发展阶段，诚邀从事肿瘤免疫学、免疫学方面的有志之士具有博士
及以上学历者加盟，负责实验室研发及管理。我们的科研、管理团队将为您提供良好的
专业发展机会。对于入聘人选，公司将提供良好工作环境与丰厚的福利和薪酬待遇。
工作地点： 厦门市翔安区厦大药学院
薪酬范围：US$ 30,000-40,00... 阅读全帖 |
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T**7
发帖数: 264 | 26 杂志是皇家化学学会的杂志，印象因子是6。
想审的同学请发给我：
1.名字
2.email
3.expertise 关键词（5个左右）
4.发表的文章
谢谢关注，希望大家好运
题目：Redox-triggered intracellular dePEGylation based on diselenide-linked
polycations for DNA delivery
ABSTRACT: Extracellular stability to protect DNA against nucleases and
stimuli-triggered intracellular DNA release are key factors in designing non
-viral gene vectors. In this study, diselenide-linked polycation mPEG-SeSe-
PEI was developed as a new type of PEG-detachable gene vector for redox-
responsive gen... 阅读全帖 |
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n******i
发帖数: 374 | 27 您好，希望能把这次机会给我，谢谢了
Yarong Liu
2623 Ellendale Pl.
Los Angeles, CA 90007
(213) 249-2419
y*******[email protected]
www.linkedin.com/pub/yarong-liu/2b/a36/65b/
PUBLICATIONS
1. Yarong Liu, April Tai, Kye-Il Joo and Pin Wang. “Visualization of DC-
SIGN-mediated entry pathway of engineered lentiviral vectors in target cells
” 2013, PLoS One 8(6): e67400.
2. Liang Xiao, Kye-Il Joo, Yarong Liu, Jinxu Fang and Pin Wang. “
Injectable thermo-sensitive hydrogel as an adjuvant: in vivo modulation of
dendritic ... 阅读全帖 |
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g******i
发帖数: 581 | 28 杨振宁 国立西南联合大学-学士(1942),硕士(1944)
1957年以中华民国公民身份获得诺贝尔物理学奖，1986年获美国国家科学奖章，1993年
获本杰明.富兰克林奖章，1995年获 爱因斯坦奖章，与李政道提出弱相互作用中宇称不
守恒.与罗伯特·米尔斯一道提出了杨-米尔斯理论，即非阿贝尔规范理论，对基础物理
学产生了深远的影响，是粒子物理学的标准模型的基础
李政道 国立浙江大学物理系/国立西南联合大学-学士 芝加哥大学博士
1957年以中华民国公民身份与杨振宁以弱作用下宇称不守恒的的发现获得诺贝尔物理学奖
吴健雄 国立中央大学数学/物理学士，先后在国立浙江大学,中央研究院物理研究所工
作美国国家科学院院士 美国国家科学奖章获得者，沃尔夫奖获得者，曾任美国物理学
会会长
1957年验证杨振宁李政道的“弱相互作用下的宇称不守恒”，1963年实验证明“β 衰
变在矢量流守恒定律”
在制造原子弹的“曼哈顿计划”中解决了链式反应无法延续的重大难题
被美国物理学会宣布为最伟大的实验物理学家之一
Madam Wu is arguably the most admired female sci... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 29 Single stranded DNA is much more difficult compared to double-stranded
plasmid DNA in terms of transformation.
Try these single stranded DNA transformation tricks.
1) transformation done at a low pH of ~6. Low pH significantly reduces the
nuclease activity of cutting single stranded DNA.
2) increase Mg++ to 1 mM. Mg is a conformation stabilizer of DNA and RNA.
3) No EDTA in the transformation system because it deprives Mg++ from the
buffer.
Han is a seasoned scientist with expertise on nucleic ... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 30 CRISPR, /ˈkrɪspər/, is a family of DNA sequences in bacteria
that contains snippets of DNA from viruses that have attacked the bacterium.
These snippets are used by the bacterium to detect and destroy DNA from
further attacks by similar viruses. These sequences play a key role in a
bacterial defence system,[2] and form the basis of a genome editing
technology known as CRISPR/Cas9 that allows permanent modification of genes
within organisms.[3]
The CRISPR/Cas system is a prokaryoti... 阅读全帖 |
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M****e
发帖数: 70 | 31 the essential step is to keep everything as clean as possible.
and do not use anything you are suspicious. Ambion is a good
company that has very good experience dealing with RNA. my
personal experience is that: ALWAYS aliquot reagents. i used
to use DEPC'd ddH2O, but now i would rather use commercial
nuclease free water. try to be a quick and clean hand, quick
and dead, you know that? i.e., you quick and RNase dead, no
no vice versa. when you deal with different biological samples,
you have dif |
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s*******e
发帖数: 23 | 32 clonist //hehe, take it easy.
generally, RT-pcr is the most sensitive assay to RNA, although sometimes
it cause pseudo positive.
However, RT-PCR can't detect isoforms, or alternative splicing products.
And because of its pseudo positive.
a northern is necessary.
However, S1 mapping of nuclease protection assay is roughly 20 fold more
sensitive than northern. Although these two methods also can't give
you the information of the full length or some isoforms' information.
all in all, these assays a |
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M****e
发帖数: 70 | 33 make sure that you are aware of the buffer effect:
It is estimated that DNA has 15% lower absorbance in TE
buffer, 23% lower in TE+saline compared to water.
1 O.D.260 are 38, 45 and 50 ug/ml for DNA in ddH2O,
TE and TES, respectively. I assume the same for RNA,
and 1 O.D.260 are 40 ug/ml for RNA in TE (from Ambion).
btw, A260/A280 is different for pure RNA
DEPC'd H2O (pH5-6) 1.60
Nuclease free H2O (pH6-7) 1.85
TE (pH8.0) 2.14 |
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a********k
发帖数: 2273 | 34 我也这样想的。对老鼠实在不觉得Znf比flx好，估计还要脏一些。因为我觉得nuclease
的specificity不会有cre高，不过效率会不会比cre高呢，可能也不会。
fly没太大必要，没有几个基因没有insertion的，fish和rat获利最大。不过rat的ESC
也出来了，不久的将来就是KO Rat了。 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 35 fly还是有用的 我知道有lab已经开始做了 因为P insertion里面hypomorph实在是
太多了。鱼确实有搞头 毕竟做不了KO也做不了RNAi 我还听说有人在蚊子里面用了
已经
nuclease
ESC |
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S*********e
发帖数: 127 | 36 Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases.
Foley JE, Maeder ML, Pearlberg J, Joung JK, Peterson RT, Yeh JR.
Nat Protoc. 2009;4(12):1855-67.
a*****[email protected]
thanks alot. |
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a***e
发帖数: 1010 | 37 try diluting your enzyme, decreasing your digestion temperature. |
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h******u
发帖数: 602 | 38 The one we currently have is from Promega nad the concentration is: 20–100u
/μl.
I plan to use 1 unit, 10 unit and 100 unit per reaction (0.5ug oligo) and
incubate on ice, room temperature and 37 C. Is this OK? |
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a***e
发帖数: 1010 | 39 sure, it is a good start. |
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S*********e
发帖数: 127 | 40 Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases.
Foley JE, Maeder ML, Pearlberg J, Joung JK, Peterson RT, Yeh JR.
Nat Protoc. 2009;4(12):1855-67.
a*****[email protected]
thanks alot |
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g********4
发帖数: 4959 | 42 你这是怎么看帖的？人家问的是general的问题，对多数buffer说的，到你这里便变成
了IP buffer了。EDTA的作用，你的回答还没原帖理解的好呢！
希望看到好的回答。
我现在的一个实验因为看到锌离子的增强作用，因此把EDTA从buffer里减了，但
protease和RNase（nuclease）明显增强，RNA-binding activity都没法分析了。
发信人: emases (sesame), 信区: Biology
标 题: Re: 请教buffer里的各种成分作用
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jul 28 17:23:06 2010, 美东)
IP buffer倒是没见过Mg和EDTA一起加的！
EDTA通常是防止蛋白在lyaste里面磷酸化的。Mg很少加在IP buffer吧？！
NaCl KCl应该区别不大？ 没做过nuclear extract。 |
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g***s
发帖数: 60 | 43 谢谢两位，
希望有更多的专家看看这个小问题。
你这是怎么看帖的？人家问的是general的问题，对多数buffer说的，到你这里便变成
了IP buffer了。EDTA的作用，你的回答还没原帖理解的好呢！
希望看到好的回答。
我现在的一个实验因为看到锌离子的增强作用，因此把EDTA从buffer里减了，但
protease和RNase（nuclease）明显增强，RNA-binding activity都没法分析了。
发信人: emases (sesame), 信区: Biology
标 题: Re: 请教buffer里的各种成分作用
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jul 28 17:23:06 2010, 美东)
IP buffer倒是没见过Mg和EDTA一起加的！
EDTA通常是防止蛋白在lyaste里面磷酸化的。Mg很少加在IP buffer吧？！
NaCl KCl应该区别不大？ 没做过nuclear extract。 |
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S*****s
发帖数: 287 | 44 我比较土，这个技术 Nature，PNAS 上都发了一堆文章了我才从 Sigma 的 rep 那里听
说。查一查文章觉得蛮吸引人，所以过来八一八。版上有没有牛人正在用这个技术？好
不好做？看起来试剂什么的都是 Sigma 垄断，做起来费用高不高？我目前正在用 BAC
做一个 transgenic mouse line，将来打算做 knock-in mouse。如果我不做 gene-
targetting 而改用 zfn 来做 knock-in，能不能降低技术难度？谢谢各位指教！ |
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a********k
发帖数: 2273 | 45 zfn是给那些没有KO的模式生物用的，主要产生移码突变，不能用来做KI。
做起来和普通的KO一样贵，没啥优势。
BAC |
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j*b
发帖数: 341 | 46 同问，有没有用这个办法做human ESC.？？？？？
老鼠的同源重组效率已经很高了，没必要用zinc。
BAC |
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g******1
发帖数: 244 | 47 Is this targeted mutagenesis or random? |
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s******r
发帖数: 2876 | 48 Jaenish lab好像有人做过。
同问，有没有用这个办法做human ESC.？？？？？
老鼠的同源重组效率已经很高了，没必要用zinc。
BAC |
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