x**w
发帖数: 112 | 1 很多做鱼的试验室在弄
最近技术又有点新的进展，6月开会的时候两个哥们（不同实验室的）宣布可以在2个月
内拿到
具体是在E.coli里面用single hybrydization 先筛一次OPEN pool library的库找
fingers, 然后用Melt Analysis 来比较高效率地筛鱼。。。
隔壁实验室弄了快一年，貌似还没拿到，不过估计没有用这个新的东东。。。 |
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a****o
发帖数: 1786 | 2 看看两伙人在NatureMethods上打架就知道没宣传的那么神奇。Unexpected failure
rates for modular assembly of engineered zinc fingers. |
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S*****s
发帖数: 287 | 3 谢谢楼上各位。我正在看这方面的文章，特别是七楼 jcb 老兄列出来的那篇，越看越
觉得不错。我做的蛋白目前没有 endogenous cell line，而我研究的方向也包括 mRNA
intron splicing。现在我都是用引入了 CMV promoter 的 BAC DNA 做 transfection
。看看这些文章我倒是想买点这个 ZFN 然后把 HEK293T 细胞的基因组改一改，改造出
一个可以 endogenous cell line 来。明天和 sigma 的 rep 继续谈谈。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 4 Sigma's technology is from Sangamo biosciences where it acquired the license
of the technology from Scripps. The technology has been in development for
over 10 years and Sagamo has over 10k of sequence specific ZFN. Academic
labs are playing catch up, and I bet Sigma can do in two months where
academic lab will take years (because Sangamo already did it but all
propitiatory). |
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O*********e
发帖数: 79 | 7 天，这个都会上首页。。
多谢wdgca的回复，我也觉得是macrophage的问题。下次用那个kit试试看
不是干透的问题，我提RNA已经有4年了，从来不用speed vacuum，都是风干的，pellet
一变透明就加TE。TE和water我都用过，做microarray的样品用nuclease-free water，
其他没那么高质量要求的时候就用TE，没发现什么区别。还有我前面说过，我同时提的
macrophage和splenocyte的RNA，后者一点问题都没有，macrophage的RNA pellet其实
还小些，但就是不溶。昨天折腾了好久，还是能看到薄薄的一片pellet飘在管子里，但
测 OD到了100ng/ul，足够一个反转录PCR了,就将就着用了。下次一定试试那个Qiagen
RNeasy Kit。也给以后要提macrophage RNA的同学提个醒，really tough pellet，要
是样品宝贵的话不要自己提，直接上kit。 |
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y******y
发帖数: 107 | 8 就是一个单链的plasmid，请问什么酶可以切除，而不能切双链的plasmid。
Mung Bean Nuclease？
T4 DNA polymerase？
谢谢。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 9 guess是不是用zink finger nuclease做的？这个也很Hot啊，
直接改基因组啊！
gene-
the |
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A****A
发帖数: 16 | 10 可以试试Zinc Finger Nuclease, Univ. Utah 的Dana Carroll 做的不错。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 11 容易做的insitu咋做咋能成，sensitive的insitu不老老实实就是自找麻烦。
formamide放久了会有ion，这个有nuclease活性，你说重要不重要 |
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s******s
发帖数: 13035 | 13 谢谢。我想看一下我的DNA里面有多少是ssDNA
另外，什么常用酶只消化ssDNA, 而不是dsDNA (我知道S1, 不过听说量大的时候也
cut两把dsDNA). |
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f**u
发帖数: 346 | 14 我晕，你不是一直见闻广博得很的吗，怎么这么有名的例子居然不知道？
这个人的donor正好是CCR5 negative的，所以这家伙白血病和爱兹一起治好了。
现在还有人在用zinc finger nuclease去target CCR5来治疗爱兹，
已经上临床了，而且就是你们学校医学院的人在做。。。 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 15 各位打扰了！在下最近想要抽提一批质粒，去打果蝇胚胎。以前我们都是用Qiagen
Maxiprep Kit抽提的（QIAfilter，有针筒的那种），照着manual来做，溶解于
nuclease-free water，转化效率不错。而最近这一批质粒也是用同样办法抽提的，转
化效率却很低。我觉得并不是我做错了，而是还可以做得更好，以弥补这批质粒本身的
缺陷。（质粒的设计或许有缺陷，但是老板拍板决定不更改设计，而是再打一轮果蝇，
所以就只能在DNA的质量上下工夫了。）
请教各位有经验的前辈，抽提转基因用的DNA有什么讲究和诀窍吗？manual上的叙述在
下已经了然于胸，但是想到真正有用的经验教训或许不著于文字，却能论坛求得，因此
求教各位。在下先谢过了！ |
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A****A
发帖数: 16 | 16 目前的观点是，HR和NHEJ是在DNA双链断裂修复中互相竞争的pathways。如果能够有效
的抑制NHEJ,HR的频率有可能会有大幅度的提升。目前，一些labs主要通过knock out或
者knock down NHEJ中几个关键player， 比如，Ku70， Ku80 以及Ligase4，来进行验
证。比较convincing的data有Dana Carroll在果蝇的研究，以及Eric Hendrickson在
mammalian cell line中的研究。Paper 如下:
Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jun 24;105(25):8703-8. Epub 2008 Jun 18.
Ku70, an essential gene, modulates the frequency of rAAV-mediated gene
targeting in human somatic cells.
Fattah FJ, Lichter NF, Fattah KR, Oh S, Hendrickson EA.
Genetics. 2009 Jul;1... 阅读全帖 |
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c********r
发帖数: 189 | 17 至少应该比zinc finger nuclease要好吧 |
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s******s
发帖数: 13035 | 18 去买点nuclease free的water吧，回来分装一大堆，反正一直会有用 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 19 这么用没什么吧 挺正常也很常用的。。NGS这么用比把这些混合物分别连克隆测序要便宜
举个例子，现在做zinc finger nuclease做mutation的很多人就这么验证ZFN到底work
了没有。 |
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C*********u
发帖数: 811 | 22 最近抽RNA用nanodrop测浓度，发现260/230ratio很不稳定，有时很好有时很低（～0.5
），而260/280 ratio却一直很好。
我已经用70%的ETOH洗两次了，而且在extraction的时候尽量避免protein和pheno污染
了，用的也是分装的nuclease free的水，实在是百思不得其解。
请问大家低260/230ratio会影响之后的RT和qPCR吗？
谢谢 |
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b****r
发帖数: 17995 | 23 illumina 454也都有错误也都不能轮回测同一个分子啊。只要某些DNA片段不会选择性
的不能通过那个pore，很难想象在足够多coverage后还会有大的gap。
nanopore不用nuclease切DNA啊，你在哪里看到的。文章里明确说了，测完后还能
recover DNA的。它这个理论上就是靠DNA不同的碱基和那个pore蛋白的物理互作测序，
可能是氢键吧
难道你以为是单细胞测序？不是的啊，打比方他说把血液直接加上去，血液里那么多白
细胞，每个里面都有两个copy的基因组 |
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f*******e
发帖数: 628 | 24 都有错误，所以 illumina 454 啥的都要事先 sample amplification。这个 nanopore
既然号称不需要 sample prep, 就需要解决单分子测序的 error 问题。当然如果
sample 本来就是 amplicon 就无所谓了。
哪个文章？他们网站上说是有两种 mode，其中一种是用 exonuclease 的。我理解那个
strand sequencing 不用 nuclease，但是具体怎么 把 double strand 弄成 single
strand，然后 single strand 通过了之后如何 recover 不是太明白。
我没以为是单细胞测序，所以才说 error 要通过 coverage 来解决。而 PacBio 的某
个解决 error 方法是循环的重复测某一个单分子，这一点 Nanopore 好像做不到，因
为我的理解是某个 strand 通过测序之后被重复测的几率很低很低。这个 error 的问
题，特别在 sample 本身很少的情况下，比如一个 finger stick 的血样，不能解决的
话就是个问题。 |
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T****i
发帖数: 15191 | 25 新技术作为技术储备到花钱不多，但只要用起来，就收不住了，铺开来，有多少钱也能
花光。
另外，不是所有的技术都有必要实现。技术不成熟的时候，完全可以等待未来更成熟的
技术再大规模铺开应用。而现实是，往往一个新技术出来，大规模应用就开始了。比如
，做酵母的同学都知道yeast knockout collections （YKO)。当时做的时候，就没引
入loxP sites，就大规模做了。用YKO strains 做double KO 就不方便。现在用zinc
finger nuclease技术做knockout mice，其实也有很多问题，但也开始大规模铺开了。
希望Sigma没从NIH拿钱做这个。
发生这种有技术马上就大规模上马的原因，主要是个人和小集团利益。有新技术，就有
忽悠钱的机会。而且，大规模做，自己5年的funding就有保障了。而且肯定能产生结果
。至于有没有用，那也肯定有的，作为工具。
还有，对技术应用能解决多少问题，事先的评估是很不够的。基本就听申请人瞎吹。讲
个例子，无论是传统的SNP／haplotype mapping，还是新一些的arrays，还是最新的
Next... 阅读全帖 |
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T****i
发帖数: 15191 | 26 新技术作为技术储备到花钱不多，但只要用起来，就收不住了，铺开来，有多少钱也能
花光。
另外，不是所有的技术都有必要实现。技术不成熟的时候，完全可以等待未来更成熟的
技术再大规模铺开应用。而现实是，往往一个新技术出来，大规模应用就开始了。比如
，做酵母的同学都知道yeast knockout collections （YKO)。当时做的时候，就没引
入loxP sites，就大规模做了。用YKO strains 做double KO 就不方便。现在用zinc
finger nuclease技术做knockout mice，其实也有很多问题，但也开始大规模铺开了。
希望Sigma没从NIH拿钱做这个。
发生这种有技术马上就大规模上马的原因，主要是个人和小集团利益。有新技术，就有
忽悠钱的机会。而且，大规模做，自己5年的funding就有保障了。而且肯定能产生结果
。至于有没有用，那也肯定有的，作为工具。
还有，对技术应用能解决多少问题，事先的评估是很不够的。基本就听申请人瞎吹。讲
个例子，无论是传统的SNP／haplotype mapping，还是新一些的arrays，还是最新的
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s*****g
发帖数: 87 | 27 Genome engineering with zinc finger nucleases. Genetics. 2011, 188, 773-782.
s*********[email protected]
谢谢！ |
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d*********e
发帖数: 18 | 28 顶，没有大牛肯赐教啊？
2M
nuclease |
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K**4
发帖数: 1015 | 31 Could you name some DNases with disulfide bonds？
Many DNases I know dont have C-C bonds， like HNH nucleases, Restriction
Endonucleases. |
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K**4
发帖数: 1015 | 32 Genome Editing: searching for Deaminase or DNA methylase or Tet1 in PubMed
The TALEN paper listed is about DNA nuclease, for cutting, not editing.
The authors seem to lack an good understanding on DNA modifications, hehe. |
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o**4
发帖数: 35028 | 33 我想给某个基因加上GFP的marker，用这个技术可以么？
据说这个东西特别贵？ |
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b******k
发帖数: 2321 | 34 现在已经没必要再搞ZFN了 TALE的精度和效率都好得多
要KI的话没有直接的办法，至少目前没有。但是也有几个组报道可以先KI个段序列，
loxP/FRT/AttP这种 然后再插入就容易了 |
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o**4
发帖数: 35028 | 35 用TALE的话，最多能插入多大的片段到基因组呢？
用这个技术加个Flag tag之类的可行吗？ |
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A****A
发帖数: 16 | 36 物种不同难度也不同。TALEN自己做不贵。
可以参考最近的Zebrafish的文章
Nature Methods | Brief Communication
TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in
zebrafish
Nature Methods
(2013)
doi:10.1038/nmeth.2374 |
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A****A
发帖数: 16 | 38 给你篇review看看：
Nature Reviews Molecular Cell Biology 14, 49-55 (January 2013) | doi:10.1038
/nrm3486
TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing
J. Keith Joung1 & Jeffry D. Sander1 |
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o**4
发帖数: 35028 | 40 方法这么多啊，晕了，
这个能做knockin吗？ |
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a***o
发帖数: 129 | 41 可以，你好好看看最近那几篇crispr有关的paper。 两篇Nat biotech， 两篇Science
，还有一篇cell，都是今年发表的，hot hot hot |
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a***o
发帖数: 129 | 45 他下手比较快，不过idea是从Charpentier那抢来的，也不是什么太光彩的事。不过也
不知道Charpentier在等啥，据说去年夏天开会时就说就已经有genome editing的data
了，结果现在悲剧了。 |
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a***o
发帖数: 129 | 46 人家开会听了一耳朵，半年就发了science，您我就不说啥了，呵呵。 |
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z*t
发帖数: 863 | 47 问个问题哈，talen切割后不是通过引入的片段同源重组来edit genome么？
楼主若是相加个gfp在同时转针对特定序列的taln + 两侧用同源片段flank的GFP
plasimid就可以了？ |
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f**u
发帖数: 346 | 48 我记得在哺乳细胞里面已经做到用GFP去tag内源蛋白了，
忘了是ZFN还是TALEN了，不过应该差不太多吧。
其他物种好像还没看到。 |
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f**u
发帖数: 346 | 49 你确定有人做了knockin吗？修改几个base pair的不算。
这些文章我就算没全看也看了大部分，没记得有楼主问的那种KI。
Science |
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f**u
发帖数: 346 | 50 理论上是这样，但是已经发表了的成功例子寥寥无几。
也许今后一段时间会井喷吧。 |
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