h******y
发帖数: 351 | 1 你这消化的时间太长了。
我的方法给你参考。
E13.5或E14.5，去头去内脏，转到一个预先装有0.25%Trypsin-0.53mM EDTA的3mL注射
器里，从20G的针头中挤过。如果组织块太大的话，多挤几次。然后在37C消化5分钟。
用FBS终止酶消化，离心收集组织和细胞，用5mL pipette重悬。每1-2个胚胎可以铺一
个10cm的dish。一两天后就长满了，这算P0。需要注意的是所有和组织接触的塑料器皿
用前需要先润湿，否则组织很容易粘到上面。
传代用0.25%Trypsin-0.53mMEDTA，37C，3-5分钟。这算P1。从这里起，seeding
density在4-5 X 10^3/cm2. 3-4天或者接近长满的时候分一次。一般在第2或3次的时候
冻足够多的细胞，1x10^6/vial. 运气好的话，一只孕鼠的6-8个胚胎分出来的MEF足够
你用的了。 |
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g****0
发帖数: 425 | 2 我都是把组织泡在Trypsin-0.53mM EDTA四度过夜，然后37度消化，一个embryo可以张3
-6盘10cm板，有何不妥吗？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 3 In my impression you need to adjust the pH to 8.0
Similar to EDTA. |
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m****n
发帖数: 1066 | 4 1.PCR product is about 200bp. PCR product was run on an agarose gel, cut off
from the gel and purified using a Qia quick gel extraction kit from Qiagen
. The elution buffer doesn’t have EDTA.
2.PCR primers were used as sequencing primers.
3.During the first try, some part of the sequence was readable. The
remaining was mixed with NNNN.
4.During the second try, I redid the PCR and gel-purification. All of the
sequences were NNN. The same sequencing contractor was used.
I like to make some change... 阅读全帖 |
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X***n
发帖数: 366 | 5 脱蜡，然后proteinase K in 1%SDS/10 mM Tris / 1 mM EDTA. 65度, 30 min。 |
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v***a
发帖数: 1242 | 6 是不是换算出错了？我配10x的直接加EDTA粉，都溶得很快。 |
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g*****n
发帖数: 250 | 7 有点奇怪。一次就配１０００ml？不会是１０X 的吧？
知道了EDTA在这里干嘛用，就不会担心它不完全溶解。就那么用吧。 |
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M********r
发帖数: 142 | 8 pls refer http://www.nature.com/ncb/journal/v15/n4/full/ncb2702.html?WT.ec_id=NCB-201304
most important is ab.
Yi Zhang used F7452 sigma. nobody won't trust yi zhang ..
ChIP-seq sample preparation.
For Kdm2b ChIP, Kdm2b Flag-tag knock-in mESCs were fixed with 2 mM
ethylene glycol bis(succinimidylsuccinate) (Thermo Scientific) for 1 h
, followed by 10 min in 1% formaldehyde and 5 min in 0.125
;M glycine to sequence the reaction. Cells were lysed in 1% SDS, 10 ... 阅读全帖 |
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z****u
发帖数: 1007 | 9 可以固定后直接OCT包埋。不过sucrose， OCT浸泡后再包埋形态会更好。sample不会是
透明的，PFA固定后都是有些褐色的，很容易就知道切到哪里了。
37度一天对荧光没有任何影响。别说一天了。。我的需要脱钙的sample经常室温EDTA脱
钙个把星期都没问题。 TdTomato非常稳定。 YFP我不太喜欢，也不是很熟悉其稳定性
。 |
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n******2
发帖数: 971 | 10 实验要检测目标蛋白在特定DNA区的结合；用histone H3抗体作阳性对照，IgG作阴性对
照；磁珠beads。发现在裂解液中加入beads-抗体后，beads会有不同程度的粘结.总体
趋势是H3〉目标蛋白〉IgG。 其中IgG-beads几乎没有粘结的现象。这个观察可以理解
为不同抗体富集蛋白的能力和总量不同，H3最强，IgG最弱。这种粘集在不同的wash
buffer处理时，没什么改变，但是当最后用TE洗的时候却一下子消失了。似乎TE破坏了
蛋白之间的相互作用使beads变得不再粘连了。
问题是TE中并没有什么特别的成分，除了不包括detergent和LiCl，Tris和EDTA的浓度
和最后的wash buffer相同。PH值TE:7.99；wash buffer:8.14也没大区别。
请同学们指教一下，为什么加了TE后，beads不再粘连了？这种现象是否暗示有蛋白产
量上的损失？以及最后一步如果省略在wash buffer 1,2,3后用TE洗beads会有什么结果？
多谢了。 |
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S******e
发帖数: 393 | 11 将S1 (cytosolic protein) 和 S3 (nuclear soluble protein?) 去掉后，剩下的
pellet再用0.1%的Triton extract, 收集到的上清暂称为X，想知道X是些什么蛋白？
Chromatin associated protein?
方法如下：
1. Cells were extracted with Buffer A (10mM Hepes pH7.9, 10mM KCl, 1.5mM
MgCl2, 0.34mM Sucrose, 10% Glycerol, 1mM DTT plus protease inhibitors)
containing 0.1% Triton for 5 min on ice, centrifuge 1300g X5 min, discard
supernatant (S1), wash once with BufferA and discard supernatant.
2. Extract cell pellet with Buffer B (3mM EDTA, 0.2mM EGTA, 1mM... 阅读全帖 |
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j****n
发帖数: 3370 | 12 Will also kill DNase activity
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.6 |
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i***l
发帖数: 1656 | 13 虽然上面有回答了。
但是，这些问题都是自己能Google出来的 |
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p****t
发帖数: 18 | 14 虽然能google出来，但是同样的答案出现在哪里可信度其实是不一样的。在这里出现的
答案以后会成为后来的人google结果的一部分，又何乐而不为呢 |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 另外，对于DNA而言，即使不存在DNA酶，在有足够的二价金属离子的情况下，也是可以
导致水解的。
一般认为DNA酶的作用是把镁离子放在一个最有利的位置从而加快这个水解过程。如果
用一个比方的话，如果说DNA酶是枪，那么镁离子就是子弹。
其实从一个化学的角度来说，大部分酶的作用无非就是把氨基酸侧链上的基团（COOH,
SH, OH,NH3, etc.)或者蛋白结合上的小分子（离子或者有机小分子)放到合适的地方让
他们进行水解或者合成（水解倒过来）反应而已。
比方说什么serine-protease, 无非就是用serine的侧链上的-OH来搞搞氢键什么的来促
进水解而已。 |
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g*****n
发帖数: 250 | 17 "我的意思是二价以上的金属离子会导致蛋白spontaneous水解。" 这个倒是很新鲜。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 18
可以粗略的认为大概就是这样子。当然如果要准确的话需要算一个比较麻烦的二元方程。 |
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y****i
发帖数: 2194 | 20 温度是关键，一定要迅速降温，整个组织先扔到ice cold pbs里面冷却
然后再捞出来上lysis buffer
要是还不行 可以混用两种cocktail, roche+sigma, 各自用1x
还有就是如果只是western DTT, EDTA之类都可以招呼上 |
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D**A
发帖数: 311 | 21 protease inhibitor 加够推荐的量就可以，多加浪费钱，效果还不一定好，可以加点
PMSF, benzamidine, EDTA之类的便宜inhibitor, 隔1-2小时补加一次就可。15%
glycerol.
先用液氮冷，然后快速解冻, 加冷的lysis buffer试试。
蛋白在室温下过夜会水解。
能想到的就这么多了。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 22 Isolation of nuclei for the co-IP and whole ChIP protocols is based on the
methods of Gendrel et al. (2002, 2005), Johnson et al. (2002), and Nelson et
al. (2006).
METHOD
For extraction and co-IP of nuclear proteins, see Steps 1-39 (Fig. 1). For
the ChIP procedure, see Steps 40-69 (Fig. 2).
Figure 1.
View larger version:
In this page
In a new window
Figure 1.
Flowchart for the timeline and organization for co-IP of nuclear proteins
from Arabidopsis seedlings.
Figure 2.
View larger versio... 阅读全帖 |
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s**********a
发帖数: 92 | 23 我们做CHIP 用的是 milippore kit.
按照他们的protocol是这样分离蛋白和DNA的：
E. Reverse Crosslinks of Protein/DNA Complexes to Free DNA
1. To all tubes (IPs and Inputs) add 8μl 5M NaCl and incubate at 65°C for
4-5 hours or overnight to reverse the DNA – Protein crosslinks. After this
step the sample can be stored at -20°C and the protocol continued the next
day.
2. To all tubes, add 1μl of RNase A and incubate for 30 minutes at 37°C.
3. Add 4μl 0.5M EDTA, 8μl 1M Tris-HCl and 1μl Proteinase K and incubate
at 45°C for 1... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 24 我的感觉是你over-treated.细胞成团往往是DNA出来的缘故。我看了我们的trypsin/
EDTA,我们用的是0。05%，比你的低五倍。
我一般的程序是：PBS洗一次后，T75加1-1。5 mltrypsin，用手转动flask,让trypsin
cover所有的细胞表面，然后把trypsin suck away。把flask放iincubator 3-5分钟就
可以了。不晃动，在microscope下改看到的都市单细胞。如果下不来，往往是PBS没洗
好，可以多洗一次。
肝细胞会例外。它们本来就抱团。这个只能靠needle来处理。 |
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I*C
发帖数: 187 | 25 EDTA 能够洗脱。是calcium dependent. |
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w*****n
发帖数: 107 | 26 any EDTA-free protease inhibitor is OK |
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v********e
发帖数: 1597 | 27 NP-40 BUFFER
1% NP-40
2 mM EDTA
10% glycerol
150 mM NaCl
50 mM Tris pH 8.0
1 tablet of Roche protease inhibitors per 10 mLs of the buffer.
400ul for 6-well; 200ul for 12-well plate, 120ul for 24-well plate |
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m****a
发帖数: 270 | 28 【 以下文字转载自 WaterWorld 讨论区 】
发信人: gluestic (), 信区: WaterWorld
标 题: please transfer to Biology. RE:Ng-Ago 重复
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jun 28 19:07:03 2016, 美东)
Single stranded DNA is much more difficult compared to double-stranded
plasmid DNA in terms of transformation.
Try these single stranded DNA transformation tricks.
1) transformation done at a low pH of ~6. Low pH significantly reduces the
nuclease activity of cutting single stranded DNA.
2) increase Mg++ to 1 mM. Mg is a conformation stabilizer... 阅读全帖 |
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F****8
发帖数: 289 | 29 这三个高超技巧应该反着理解吗？
1）pH应该大于6，因为低pH降低切酶活性。
2）Mg++应该小于1nM，因为Mg++使DNA/RNA更稳定。
3)实验应该加EDTA，可以络合镁离子。 |
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F****8
发帖数: 289 | 30 您是韩老师吗？
这是你上月的帖子。
Single stranded DNA is much more difficult compared to double-stranded
plasmid DNA in terms of transformation.
Try these single stranded DNA transformation tricks.
1) transformation done at a low pH of ~6. Low pH significantly reduces the
nuclease activity of cutting single stranded DNA.
2) increase Mg++ to 1 mM. Mg is a conformation stabilizer of DNA and RNA.
3) No EDTA in the transformation system because it deprives Mg++ from the
buffer.
Han is a seasoned scientist with exp... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 31 只用他们的medium和trypsin-EDTA.
reserve |
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m****a
发帖数: 270 | 33 其他部分大同小异，贴一下关键的note部分
Note:
1. NgAgo/gDNA system is extremely sensitive to contamination of
intracellularbacteria (including mycoplasma) which are widespread
and leave no visible signs of presence. Carefully excluding the
presence of intracellular bacteria before performing experiments.
2. Because Agos need magnesium, avoid EDTA when detaching and seeding cells
into the plates for transfection. Alternatively, supplementing Mg 2+ to 5 mM
(may need optimization to your cell type).
3. Avoid using L... 阅读全帖 |
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s*********y
发帖数: 292 | 34 嗯，让大家去配个没有EDTA的trypsin去试试
说实话，我不觉得这跟做不做的出来有啥关系…… |
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F****8
发帖数: 289 | 35 这个 protocol 和 gluestic 六月28号发的三个tricks 中的两个能对得上。
看来 gluestic 和春雨有很近的联系。
下面是他当时的帖子：
Single stranded DNA is much more difficult compared to double-stranded
plasmid DNA in terms of transformation.
Try these single stranded DNA transformation tricks.
1) transformation done at a low pH of ~6. Low pH significantly reduces the
nuclease activity of cutting single stranded DNA.
2) increase Mg++ to 1 mM. Mg is a conformation stabilizer of DNA and RNA.
3) No EDTA in the transformation system because it de... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 36 【记录历史】NgAgo'2016 - Milestones draft 第一阶段时间点补充：
（added on 2016年8月30日）
由于这则信息和以后第二阶段里的Addgene updated protocol有些相似之处
为了承前启后，也一并收入 第一阶段的milestones
Date：2016年06月28日
(NBT paper 上线近两个月以后）
(方舟子第二篇文章发表两天之前）
Title：please transfer to Biology. RE:Ng-Ago 重复
（发布于WaterWorld版）
Link:
http://www.mitbbs.com/article_t/WaterWorld/2680181.html
Key Points：
1. 提到3个关于optimize ss DNA “transformation tricks"
“Try these single stranded DNA transformation tricks.
1) transformation done at a low pH of ~6. Low pH significant... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 37 【记录历史】NgAgo’2016 – 第一阶段Milestones 修订版
我们生活在一个奇妙的时代。
在这个时代，由于生物技术的进步，我们的生老病死，我们的衣食住行， 都
在不断地经受着各种微妙的，或是革新性的变化所带来的压力。
我们的思维方式，我们的行为准则，我们的道德底线，也在不停地被考验着。
到了2016年，CRISPR/Cas9基因编辑技术，已经日渐成熟。任何生命体，包括
我们赖以繁衍的生殖细胞，我们的DNA，都有可能很容易被修改。基因编辑技
术的应用，也成为了各种投资的宠儿。
而在2016年夏天，中国河北科技大学的韩春雨实验室，在Nature
Biotechnology（NBT）杂志上，发表了一篇论文，宣布了一个“新的、高效
的基因编辑技术 – NgAgo/gDNA”的诞生。
这篇文章，引起了世界各地业界同行的广泛重视，大规模重复验证NgAgo基因
编辑功能的各种信息，在网络上不断地更新着。
三个多月了，无法重复验证NgAgo的数据不断地出现，至今为止，还没有人能
够发布任何正式的，可重复实验结果。
研究人员们越来越困惑，也越来越担心，韩春雨和他的同事们在NBT发表的
Ng... 阅读全帖 |
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m****a
发帖数: 270 | 38 Welcome back. Brother Jianghu. You are the first to suggest EDTA need to be
avoided in Ngago transfection.
You are truly a legend.
unfunctional |
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z******5
发帖数: 200 | 39 发现实验室最近的Tripsin-EDTA过期了4年，但还在用，没问题吗？
生物试剂一般可以过期使用吗？ |
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A****w
发帖数: 244 | 43 did you use EDTA during the protein prep?
Or just some modification to your sample.. |
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i*******D
发帖数: 993 | 44 tris, boric acid, edta 配置出的tbe buffer。已知各个溶质的量。还有各个 pka,
pkb。该怎么求溶液中各种离子的浓度呢？就是求他们的分布系数对吧？那么是不是就
列几个质子平衡方程。貌似这个ph值我也不知道。
有一个文献 ionic effects on the equilibrium dynamics of dna confined in
nanoslits 里面测了不同浓度下这个buffer的离子强度。我的问题是，上述方法能算出
来吗？根据pka pkb那些算出的值跟实际相符得好吗？ |
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u**********a
发帖数: 50 | 47 请问您的专业是不是Environmental？
？ |
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s********3
发帖数: 40 | 48 求救。。。
有大侠知道HPLC如何分离这四种物质，苯甲酸，对二苯酚，EDTA(乙二胺四乙酸),三羧
基乙二醇，
可以选择下面的条件；
Conditions
Column: C18 Silica ，C8 Silica， Cyano phase,SiOH, PS-DVB, SAX
Column Size: 4.6 x 15cm 2.1 x 10cm
Detector: ELSD Diode Array MS
Initial Gradient Condition:
Final Gradient Condition:
Sample dissolved into:
Injection volume: |
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G*******X
发帖数: 1028 | 49 根据四个物质的性质，先选detector
1. Detetor: ELSD就是个joke。直接pass。EDTA(乙二胺四乙酸),三羧
基乙二醇，没有Uv吸收峰，所以要用质谱. Infuse injection of the four compounds
respectively to choose proper m/z for monitoring.
2. 质谱可以handle的flow rate比 diaode array小，所以column size 2.1x10cm
3.四个化合物三个是酸，极性都很强，C18、和C8留不住他们，会在void的时间流出的。
SAX是离子交换柱，一般mobile phase要加较大浓度的盐溶液，不适合质谱检测。
PS-DVB看产品介绍是只是用来将polar化合物从nonpolar化合物中分离出来的，像是纯
化用的。column本身没有官能团，对polar化合物没有分离作用。
SiOH，是normal phase column。是个选择。不过正相柱对水分很敏感，repeatability
有时候不好，不建议用。
Cyano如果是HILIC phas... 阅读全帖 |
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j******0
发帖数: 258 | 50 含有EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid), NaCl的水溶液,通入ethylene oxide
,应该有什么样反应?
Thanks! |
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