H*******i
发帖数: 196 | 1 另外随手下了个这个质粒GB文件，如果没错的话
aacagaaggCTCGAGgtaaccGGATCCtgatcaGAATTCaagggg
依次是XhoI BhamHI EcoRI 用BhamHI看着没啥问题啊？
如果要用XhoI 和EcoRI
首先你需要找一个载体 就当是PUC+Kan/clora这种
没有XhoI EcoRI MluI
然后把pGIPZXhoI到MluI clone到你的工作载体上，再用XhoI EcoRI插入目标序列，最
后用XhoI MluI切回你的pGIPZ 以后所有的clone都在工作载体上，所以一直用下去每次
也就多花3天/4天时间。 |
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y***i
发帖数: 11639 | 3 定一对probe改造一下就可以了。
比如 pQE70酶切位点是 EcoRI-BamH1-Hind3. 你可以定一组probe，anneal后两边分
别是EcoRI 和 Hind3的位点，中间有BamH1但是和HindIII用4 5个bp隔开。然后把
construct用EcoRI 和 Hind3酶切--连接，以后用就很方便。 |
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s*****g
发帖数: 87 | 4 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
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s*****g
发帖数: 87 | 5 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
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s*****g
发帖数: 87 | 6 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
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s******y
发帖数: 28562 | 7 所以我也很吃惊啊，因为上面有同学说BamHI 可能是构建质粒的时候带进去的，
可能不是给我们用来克隆的。但是明明这个BamHI是夹在XhoI 和EcoRI之间的啊，
如果用XhoI 和EcoRI的话就会把BamHI切掉的啊。所以干吗要这么麻麻烦烦的移来移去
啊，直接用XhoI和BamHI不是更简单么？
不过也有同学指出说那个公司以前的shRNA可能都是用XhoI 和EcoRI构建在pSM2里面的
，所以有可能他们为了省事就将错就错的直接用XhoI和MluI 把一大块东西都剪过去算
了 (不过居然这样也能发个Nature Method...) |
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h**********r
发帖数: 671 | 8 我准备考虑Gibson assembly了，先问你一个很挫的问题哈。
1).比如我用EcoRI线性化质粒，作为assembly的一部分。切开后是这样子的吧？
------G AATTC-------
------CTTAA G-------
vector的两头不是平末端了，应该怎么设计overlap啊？还是两边直接用EcoRI (GAATTC
)的序列？感觉又不完全互补了。如果用overhang的话，只和一条链互补，那样EcoRI就
没了？这个nick是咋整的呢？
2).另外今天又挫了一把，在IDT合成两个片段忘记加overlap了。只能再靠PCR的引物加
这个overlap。他家的750bp-510bp一个价。应该刚好合成到750bp左右。这个overlap多
长比较合适？NEB说20bp多够了,有的说不够。
2).另外一个问题：可以把Gibson assembly的产物直接作为模板PCR得到全长吧？要表
达的制粒不方便测序。想把得到PCR产物一部分用来酶切克隆表达，一部分用来AT克隆
测序。
多谢了！ |
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c*******o
发帖数: 8869 | 9 digestion of PCR product can be very tricky, what i do is following:
1 purify your PCR product with qiagen kit
2 use T4 PNK phosphorylate your PCR product's blunt end
3 ligate your blunt PCR fragment into any vector cutted with blunt end enzyme
(like EcoRV)
4 transformation and mini prep plasmid
5 then use hindIII and EcoRI cut the fragment out of vector
6 purify your hindIII-EcoRI fragment with kit and insert it into the vector
you want to use
this will add one more subcloning step but i am sur |
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h**********r
发帖数: 671 | 10 在此拜过克隆达人，跪求葵花宝典。
我正好有个克隆要做，就是teminator-promoter-ORF-terminator.
一看酶切位点设计的正好是：
pUC19 (HindIII)-(HindIII)terminator(PstI)- (PstI)promoter (XbaI)- (XbaI)ORF(
KpnI)-(KpnI)terminator(EcoRI)- pUC19 (EcoRI)
片段都不大。
请问葡萄MM，我这个能crazy一把吗？我做克隆也是身经百战了。
直接切PCR产物就OK了吧？
多谢！
实验成功，必有包子酬谢！ |
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h**********r
发帖数: 671 | 11 最近做一个克隆（NdeI/EcoRI），PCR验证是好好的。用PstI验证也正确。可就是用
NdeI/EcoRI酶切不对。
载体和片段都比预期的要大。而且不知道为啥弥散。
麻烦大家帮忙看一下图吧。多谢！ |
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S******e
发帖数: 393 | 12 想用SalI-NheI double digetion,
NEB suggest sequential,
但我看到SalI和EcoRI double digestion 用 E.coRI buffer
NheI 和 EcoRI double digestion 也用E.coRI buffer
是不是SalI-NheI double digestion 就可以用E.coRI buffer，
而不用sequential了？
多谢回答！ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 13 Sounds reasonable.
But key point is 让人怀疑作者检测到的human HBV infected cccDNA是否是真的
human HBV infected cccDNA?
details please refer
. 文章中用Southern blotting检测到了cccDNA的形成。cccDNA是HBV转录的膜板，被认
为是HBV持续感染的关键因素。从结果来看cccDNA的形成时间与HBV蛋白、RNA和DNA相比
比较早，尤其量很高。其实对于HBV来说哪怕是CMV启动的HBV（比如pCMV-HBV）cccDNA
的量都是很低的，更不要说是自身启动子启动的了。在NTCP介导的HBV复制水平整体很
低的情况下，具有高水平的cccDNA形成，让人怀疑作者检测到的cccDNA是否是真的
cccDNA，所以作者必须证明他们所指示的条带是真的是cccDNA，必须用EcoRI酶切（
cccDNA能被EcoRI线性化）和加热煮沸cccDNA（沸腾后不会被解成单链）来确证，同时
必须要有阳性对照。当然对于鸭乙肝病毒（DHBV）
http://blog.scien... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 14 Sounds reasonable.
But key point is 让人怀疑作者检测到的human HBV infected cccDNA是否是真的
human HBV infected cccDNA?
details please refer
. 文章中用Southern blotting检测到了cccDNA的形成。cccDNA是HBV转录的膜板，被认
为是HBV持续感染的关键因素。从结果来看cccDNA的形成时间与HBV蛋白、RNA和DNA相比
比较早，尤其量很高。其实对于HBV来说哪怕是CMV启动的HBV（比如pCMV-HBV）cccDNA
的量都是很低的，更不要说是自身启动子启动的了。在NTCP介导的HBV复制水平整体很
低的情况下，具有高水平的cccDNA形成，让人怀疑作者检测到的cccDNA是否是真的
cccDNA，所以作者必须证明他们所指示的条带是真的是cccDNA，必须用EcoRI酶切（
cccDNA能被EcoRI线性化）和加热煮沸cccDNA（沸腾后不会被解成单链）来确证，同时
必须要有阳性对照。当然对于鸭乙肝病毒（DHBV）
http://blog.scien... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 16 BMJ
Gut is not trash journal
this journal 2013 one review
web link:
http://gut.bmj.com/content/62/8/1093.extract
its pp1094 left column top
cited here stuff sentence,
>Surprisingly, Yan et al did not provide
>Southern blot data demonstrating accumulation
of HBV DNA replication intermediates,
as this electrophoretic pattern is
a signature of productive virus replication.
Only one subfigure shows some evidence
of cccDNA formation, which
defines a successful infection by HBV;
however, unlike HBV DN... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 17 you guy if Li and or Sui lab could get 清晰的条带 for it by any modified
protocol,
the manuscript at least will be released on Cell Host&Microbe,
http://www.bioxbio.com/if/html/CELL-HOST-MICROBE.html
or if got new mechanism of HBV Immuo aspect then to
N Immu,
http://www.bioxbio.com/if/html/NAT-IMMUNOL.html
Do you think those labs only think e@life is better than
Cell Host&Microbe similar rank other journals.
ps:
But key point is 让人怀疑作者检测到的human HBV infected cccDNA是否是真的
human HBV infected cccDNA?
de... 阅读全帖 |
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a**********9
发帖数: 348 | 18 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: alexandria99 (抗癌中), 信区: Military
标 题: 1958-1976一个中国特工的海外传奇：我被祖国情报部门选中(ZT)
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jul 19 20:34:56 2008)
可以拍一部惊险电影了！
来源: EcoRI 于 08-07-13 14:13:32 [档案] [博客] [旧帖] [转至博客] [给我悄悄话
]
1958-1976一个中国特工的海外传奇
金边长大 西贡读书
我被祖国情报部门选中
1958年秋天，我，一名出生在金边、曾在西贡读书、1950年回国参加社会主义建设的青
年华侨——常修文，突然被党组织选中，奉命加入中国的隐秘战线，参与境外情报搜集
工作。
接到组织调令，我既兴奋，又紧张。即使在刚刚踏入隐秘战线的那一刻，我也能够大致
猜测到这种工作的艰难性和危险性，但我更加明白：一个革命者，必须随时随地听从党
的召唤，无论将来遇到什么样的危险，都要坚持到底，战斗到底！
集中训练 奉派出国
我潜回了自己的第二故乡 |
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m********r
发帖数: 811 | 19 来源: EcoRI 于 09-09-10 23:36:55 [档案] [博客] [旧帖] [转至博客] [给
我悄悄话]
这是第二炮兵原司令员李旭阁夫人耿素墨向我讲述的一个故事，装在我心中多
年了，每每想起，感慨不已。
那是上个世纪八十年代中期，“两弹一星”功臣邓稼先罹患癌症去世后，他的夫人许鹿
希，一直沉浸在高贵爱情里的世家之女，无法自拔。不仅原封不动摆放着邓稼先生前家
里所有物品、书籍和纸条，任其岁月烟云褪色，尘埃落下，而且开始做一件事情，追踪
当年到过核试验爆炸中心的两弹一星功臣的身体状况。时间不知不觉地过去了十几年，
当首次核试验的主要指挥者和核科学家一一去世后，她发现，他们中间的不少人都是因
为身患肿瘤而逝。
这似乎成了到过爆心的勇士们一个命运的咒符。但是也有人例外，那就是时任第二炮兵
司令员的李旭阁中将。首次核试验后第二天，李旭阁曾坐直升机飞过原子弹铁塔上空，
久久盘旋，观察铁塔的毁伤情况，当时的爆心核沾染极强，如果要算吃的核辐射最多，
非他莫属。但他的身体一直很好，是一个异数。
2001年4月，一个不幸 |
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w*****m
发帖数: 414 | 20 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: mayo (千万别笑), 信区: Biology
标 题: 生物博士的死期
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Dec 23 20:52:54 2012, 美东)
一生物博士意外去世变为厉鬼，法师收服他后为其普渡超生，问他：年轻人，超生后要
干嘛呀?答：超声?超声后离心取上清上镍柱!
法师摇摇头说：“年轻人，我看你资质不错，想不想我培养你啊?”答：“培养?你一没
血清二没1640，拿什么培养我啊?”
法师大怒说：“莫非你一心要去地狱?也罢，十八层地狱个个酷热难耐，你随便挑一个
吧。”答：“哪个地狱是95-60-72度循环的?”
法师说：“你就不怕我把你打成孤魂野鬼吗”?“野鬼是野生型吗”?生物博士问道。
法师和生物学博士说：“听说那唐三藏将前往西天取经，不如你就前往西方的部落投胎
迎接唐三藏吧”。生物学博士说：“恐怕我看到三藏法师我也识别不出，因为我
Western Blot做得不好”
法师问生物学博士：“你是怎么死的”?生物学博士说：“游泳的时候，被闪电击中触
电死的。。”。法师问：“请问姑娘芳名是否为凝娇?”
法师：来... 阅读全帖 |
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b*******0
发帖数: 1695 | 21 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: mayo (千万别笑), 信区: Biology
标 题: 生物博士的死期
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Dec 23 20:52:54 2012, 美东)
一生物博士意外去世变为厉鬼，法师收服他后为其普渡超生，问他：年轻人，超生后要
干嘛呀?答：超声?超声后离心取上清上镍柱!
法师摇摇头说：“年轻人，我看你资质不错，想不想我培养你啊?”答：“培养?你一没
血清二没1640，拿什么培养我啊?”
法师大怒说：“莫非你一心要去地狱?也罢，十八层地狱个个酷热难耐，你随便挑一个
吧。”答：“哪个地狱是95-60-72度循环的?”
法师说：“你就不怕我把你打成孤魂野鬼吗”?“野鬼是野生型吗”?生物博士问道。
法师和生物学博士说：“听说那唐三藏将前往西天取经，不如你就前往西方的部落投胎
迎接唐三藏吧”。生物学博士说：“恐怕我看到三藏法师我也识别不出，因为我
Western Blot做得不好”
法师问生物学博士：“你是怎么死的”?生物学博士说：“游泳的时候，被闪电击中触
电死的。。”。法师问：“请问姑娘芳名是否为凝娇?”
法师：来... 阅读全帖 |
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d**b
发帖数: 1286 | 22 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: mayo (千万别笑), 信区: Biology
标 题: 生物博士的死期
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Dec 23 20:52:54 2012, 美东)
一生物博士意外去世变为厉鬼，法师收服他后为其普渡超生，问他：年轻人，超生后要
干嘛呀?答：超声?超声后离心取上清上镍柱!
法师摇摇头说：“年轻人，我看你资质不错，想不想我培养你啊?”答：“培养?你一没
血清二没1640，拿什么培养我啊?”
法师大怒说：“莫非你一心要去地狱?也罢，十八层地狱个个酷热难耐，你随便挑一个
吧。”答：“哪个地狱是95-60-72度循环的?”
法师说：“你就不怕我把你打成孤魂野鬼吗”?“野鬼是野生型吗”?生物博士问道。
法师和生物学博士说：“听说那唐三藏将前往西天取经，不如你就前往西方的部落投胎
迎接唐三藏吧”。生物学博士说：“恐怕我看到三藏法师我也识别不出，因为我
Western Blot做得不好”
法师问生物学博士：“你是怎么死的”?生物学博士说：“游泳的时候，被闪电击中触
电死的。。”。法师问：“请问姑娘芳名是否为凝娇?”
法师：来... 阅读全帖 |
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m*******r
发帖数: 13263 | 23 发信人: mayo (千万别笑), 信区: Biology
标 题: 生物博士的死期---zt
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Dec 23 20:52:54 2012, 美东)
一生物博士意外去世变为厉鬼，法师收服他后为其普渡超生，问他：年轻人，超生后要
干嘛呀?答：超声?超声后离心取上清上镍柱!
法师摇摇头说：“年轻人，我看你资质不错，想不想我培养你啊?”答：“培养?你一没
血清二没1640，拿什么培养我啊?”
法师大怒说：“莫非你一心要去地狱?也罢，十八层地狱个个酷热难耐，你随便挑一个
吧。”答：“哪个地狱是95-60-72度循环的?”
法师说：“你就不怕我把你打成孤魂野鬼吗”?“野鬼是野生型吗”?生物博士问道。
法师和生物学博士说：“听说那唐三藏将前往西天取经，不如你就前往西方的部落投胎
迎接唐三藏吧”。生物学博士说：“恐怕我看到三藏法师我也识别不出，因为我
Western Blot做得不好”
法师问生物学博士：“你是怎么死的”?生物学博士说：“游泳的时候，被闪电击中触
电死的。。”。法师问：“请问姑娘芳名是否为凝娇?”
法师：来呀!把这个孽鬼绑上柱子!
生物博士：上... 阅读全帖 |
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t****3
发帖数: 6964 | 24 提问: 用EcorI 来限制性内切博导14寸内的DNA, 需要2小时内完成酶切，在最适条件下
需要多少酶来参与反应？ |
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j*****7
发帖数: 10575 | 25 http://www.godoor.net/text/science/ztlz12.htm
基督徒在基因革命中的立场
潘柏滔
1996年诺贝尔化学奖得主柯尔博士（Dr. Robert F. Curl, Jr.）曾声言∶二十世
纪是物理学和化学的世纪，但二十一世纪将是生物学的世纪。自从1953年屈臣（James
D. Watson）和克瑞格（Francis H.C. Crick）历史性首次发表去氧核酸（即基因）的
双旋模型（double helix model），分子遗传学（molecular genetics）便发展成为生
命科学的主流。1973年，贝亚（Herbert Boyer）和科恩（Stanley Cohen）成功地以质
体基因（plasmid pSCIOI）和内分解酵（restriction endonuclease EcoRI）制成第一
枚重组的去氧核酸（recombinant DNA），为基因革命和生物科技拉开了时代的序幕。
1983年，穆里士（Kary Mullis）发明聚合酵连锁反应（polymerase chain reaction）
，能在数小时内将一枚去氧核酸放 |
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w****i
发帖数: 634 | 26 【 以下文字转载自 Food 讨论区 】
【 原文由 EcoRI 所发表 】
这东西米国有得卖吗
南方叫濑尿虾，北方叫皮皮虾，东北叫虾耙子 |
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l*****k
发帖数: 587 | 27 Well, I am sure I am not the first to do this, but I do want to share it
Sometimes, cloning multiple things into a vector can be tedious as you
have to transfer the fragments through several vector to get the
desired one, usually because the existence of the same Restriction site
in the vector and the fragment you want to clone.
say a gene has 2 frags in two separate vector, now you wanna get
them ligated into the same vector.
EcoRI------------XhoI Frag I (has interal BamHI site)
XhoI- |
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c**A
发帖数: 1474 | 28 first of all, everything could happen in biology.. hehe..
so, for trouble shooting:
1. run gel to check your sample before digestion but after
purification.
OK --> digestion problem
smear --> purification problem.
2. if purification problem, try to use a PCR purification kit.
3. if digestion problem.
A. make sure the fragment you cloned did not contain any
HindIII/EcoRI
B. try a sequencial digestion..
4. just a reminder:
HindIII will have prolbem to cut when your si |
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s*******e
发帖数: 740 | 29 Thank you for carefully read my post.
你说的对，我只是将问题简化来说了，实际情况要复杂一些
我设计的vector包含3个loxp sites，前两个夹着一个exon，第二个和第三个夹
着一个neo基因，这是很常规的设计方法，整个insert region很大，有3k左右
我可以通过southern blot来检测homologous recombination，因为这个insert
引入了一个新的EcoRI site
我的确得到了homologous recombinated干细胞，并用它做了老鼠，但当我用这个老鼠
和Cre mouse杂交时，我怎么也看不到Cre－loxp recombination
仔细检查才发现第一个loxp site莫名其妙得丢了
如我前面叙述的，这个loxp site夹在两个NcoI site中间，它前面和后面很近
的DNA都进去了，就是这一段丢了 |
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f*********e
发帖数: 43 | 30 Don't lose your heart. If you can't do it try another way. Here is my
suggestion.
You have two fragments. If you have friends do cloning. Ask them what is
fusion PCR? design primers
with overlapping 21 nt, you can do three fragments, take one more that is in
the vector, e.g. lac region
has many restriction sites you can use!!!! do first round PCR separately,
then take a little bit each as
tamplate, use the first primer and last primer with familiar enzymes!!! such
as BamHI, EcorI, SmaI etc. |
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X***n
发帖数: 366 | 31 I cloned 400-500 bp miniarms cloned into ptdTomato-C1, and then linearized
it with EcoRI, so that the backbone was flanked by miniarms on both ends. I
electroporated the linearized plasmid into the induced Red recombinases in
SW102 carrying my BAC. All the clones turns to be empty. I succeed in the
other two using pKD46 system but failed in this one. And now I also fail
using SW102 system. What's the most possible reason? Thanks in advance. |
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b******r
发帖数: 111 | 32 Anyone has experience of inserting 9kb in a 8.4kb vector? 2 months was gone
,but I get nothing. Would
you like to take a look a this protocol and give me some suggestion ?
Thanks a lot
Purpose: Insert 9kb mouse sequence into vector pPNT6.
Vector pPNT6: Its map is at http://www.addgene.org/pgvec1?
f=c&identifier=11072&atqx=pnt6&cmd=findpl . I have inserted 0.9kb DNA in
this vector at XhoI/EcorI
double sites. I should have no problem in cloning short fragment.
Insert DNA is 9kb.I have cloned t... 阅读全帖 |
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m*********7
发帖数: 606 | 33 首先，你有没有确定这个菌的chromosome有多大？有没有你这两个酶的酶切位点？
其次，按照识别位点6个碱基来算，4096个bp才能随机出现一个EcoRI的位点，考虑正反
向的话减一半就是2048bp。你跑胶的浓度是否合适来区分切开和没切开的状态？
你的描述中并没有出现非酶切对照，你是如何判断没切开的？
另外，你的实验目的是什么？为啥要用这两个酶来切？ |
|
a*****a
发帖数: 415 | 34 fermentas的酶没用过
neb的用 neb double digest finder查
ecori和bamhi如果都是HFversion的可以用buffer 4做double digest
bamhi如果不是hf version最好在buffer3切，不然star activity强 |
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k****o
发帖数: 589 | 35 之前用EcoRI切过吗？如bulletin说的，像是裂解步骤出的问题。 |
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h******y
发帖数: 351 | 36 1. 你抽提的DNA有问题。
2. 试试其他酶，例如EcoRI
by the way, 你用的酶量太大。
did
not |
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j****x
发帖数: 1704 | 37 终于得闲可以坐下来写点东西了，喘口气先。
首先，这篇评论是目前我看到的写得相对最中肯的一片，原因很简单，作者确实是这个
领域的人，且就事论事，没有想很多人那样屁股决定脑袋。文章的开头和结尾已经给作
者的态度清清楚楚定了基调。所以有人希望用这篇评论来扯什么“皇帝的新衣漏洞百出
”的淡，请回头再仔细看看作者自己的是怎么明确表态的。当然某些人惯于断章取义，
这些人不早生个40-50年真是太浪费了。
闲话不表了。一篇好paper，并非一定是十足完美而没有质疑的，但一篇好paper一定是
经得起质疑经得起时间考验的。眼下很多实验室包括作者包括我自己都正在基于NTCP这
一新发现进行新的研究，时间自然会说明一切。
这篇文章，指出了原paper中的诸多不足，其中的一部分我也是很同意的，事实上拿出
任何一片CNS paper，基本都可以照猫画虎的说出个123点不足和缺陷来。至少我们在开
journal club的时候，无论出自哪个杂志/谁人之手，还没有哪篇paper能幸免的。重要
的问题是，这些质疑和不足，是否根本性的动摇了文章的基本结论，还是只不过是需要
锦上添花再进一步或者揭示了下一步需要的后续工... 阅读全帖 |
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m**o
发帖数: 9137 | 38 一生物博士意外去世变为厉鬼，法师收服他后为其普渡超生，问他：年轻人，超生后要
干嘛呀?答：超声?超声后离心取上清上镍柱!
法师摇摇头说：“年轻人，我看你资质不错，想不想我培养你啊?”答：“培养?你一没
血清二没1640，拿什么培养我啊?”
法师大怒说：“莫非你一心要去地狱?也罢，十八层地狱个个酷热难耐，你随便挑一个
吧。”答：“哪个地狱是95-60-72度循环的?”
法师说：“你就不怕我把你打成孤魂野鬼吗”?“野鬼是野生型吗”?生物博士问道。
法师和生物学博士说：“听说那唐三藏将前往西天取经，不如你就前往西方的部落投胎
迎接唐三藏吧”。生物学博士说：“恐怕我看到三藏法师我也识别不出，因为我
Western Blot做得不好”
法师问生物学博士：“你是怎么死的”?生物学博士说：“游泳的时候，被闪电击中触
电死的。。”。法师问：“请问姑娘芳名是否为凝娇?”
法师：来呀!把这个孽鬼绑上柱子!
生物博士：上柱子很关键，不然影响纯化回收的效率。我建议你们买进口的柱子。
法师：来呀!把这个恶鬼切了!
生物博士：用什么酶?EcoRI还是HindIII?
法师：我一定要给你点颜色看看!
生物博士：神马... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 40 谢谢！我的疑惑也就是因此而来的。因为E.coRI 不能直接用（在pGIPZ上有另外一个切
点）。但是在XhoI 和 EcoRI 之间其实还有一个BamHI, 这个倒是唯一切点的。
我就很奇怪他们为什么不直接用XhoI 和 BamHI 来做插入。
另外。我的一个问题是，在插入那个shRNA 序列的时候，是只插那识别的22Nt anti-
sense sequence呢，还是连旁边的stem 也一并插入（总共放进６０Nt大小
的序列？） |
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a****n
发帖数: 43 | 41 他们最初用的载体是pSM2,在那里用XhoI和EcoRI是可以的。pGIPZ上的BamH1应该是构建
载体的时候引入的，并没有用作多克隆位点。
需要连旁边的stem一起插入。在Xho1和EcoR1之间应该是stem-sense-loop-antisense-
stem.
pGIPZ用Xho1，Mlu1切；插入序列按Hannon文章中的方法PCR后用Xho1，EcoR1切（后直
接合成）；切下pGIPZ上的EcoR1，Mlu1片段（235bp）； 做三片段连接就可以了。 |
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f******g
发帖数: 1003 | 42 把那个EcorI突变了，就可以了。一两天的工作。 |
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c*******7
发帖数: 314 | 43 tet on的可以用obs的pTRIPZ，有荧光，XhoI、EcoRI clone很好用，最好design 3‘
mismatch。pGIPTZ没用过，可以打电话问 |
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s******y
发帖数: 28562 | 44 这就是我感到非常疑惑的一点。因为我打电话问过pGIPZ 的相关公司，他们告诉我
说他们克隆的时候都是非常间接的，还指给了我两三篇文章，包括一篇在Nature
Method上的，上面用的方法都是非常间接的用XhoI 和 MluI 把一个非常大的cassette
在不同质粒之间移来移去的做法 （顺便吐槽一下，当时我看了其中一篇文章之后就
想，怎么这个纯粹讲克隆方法的文章也能发Nature Method？他们对文章要求到底是什
么标准啊？）
所以我就非常疑惑的是，他们为什么不象你说的那样做？因为要改一下那个EcoRI是很
容易的事情啊。莫非是改了之后有什么奇怪后果？ |
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H*******i
发帖数: 196 | 45 10K多的质粒有时候修改操作起来麻烦点？有的实验室用惯了可能也就习惯了，因为他
们的操作都在另外两个工作质粒上，每次只需要把基因修改在工作质粒上，然后连成这
个载体就行了。。
看图谱EcoRI在HygroR那个位置，只要换个同义突变就行了 |
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f******g
发帖数: 1003 | 46 因为open biosystem最开始使用的是pSM2质粒，设计好的shRNA全部克隆到这个载体里
面，后来有了慢病毒lentiviral vector（pGIpz），他们就把原来的psm2的shRNA全部
克隆到新的pgipz上面，另外还有新设计的shRNA。
突变掉另外那个EcorI没有任何影响，我们已经做了。
还有，如果你想转干细胞，至少是造血干，pGIPz不是一个很好的选择，因为他的启动
子是CMV，转干细胞效率极低。如果是普通的细胞系，应该没有问题。原代细胞，我没
有试过。
如果你实在没有好的选择，短信我，我有修饰过的pGIPz载体，很好用。但是要和老板
签署MTA。
cassette |
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s******y
发帖数: 28562 | 47 谢谢大家给了那么多的好建议！我一开始就想动手去改那个pGIPZ 里面的MCS site
的。其实即使不用改，在那个XhoI - EcoRI 旁边就有一个BamHI。所以我非常疑惑那个
公司为什么放着这么简单的方法不用而非要那么麻烦的在不同的质粒之间倒腾。但是听
起来貌似是他们的shRNA 很就以前就做在pSM2里面了所以就将错就错的啊。
不过上面一个好心的网友和另外一个发私信给我的网友都告诉了我要小心这个CMV
promoter, 这么一听我就有点介意了。因为虽然我主要用的是immortalized 细胞系,但
是偶尔也会整整一些primary cells, blood cells 之类的。如果CMV 有这个问题的话
我就不想在上面投入太多精力了。
我在addgene 上找另外两个网友说的荧光标记的shRNA vector 的时候，非常碰巧的看
到了这个 pLKO.3G, 上面的说明是 pLKO.1-puro 改成的。不知道有没有人用过？ http://www.addgene.org/14748/
如果这个好用的话我可能就用这个了。因为我的好几个其他shRNA construct 都... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 48 对于问题（1），就是你把自己最后要得到的质粒用手画也好，用软件也好，序列整出来
把inseert的部分highlight
就可以看的比较清楚了
决定好insert的部分以后，再往上游数个15－20bp（看手册怎么说）就可以
Gibson的是从5'端chew back
你可以选择保留质粒上的酶切位点（比如你这里的EcoRI）或者不保留
看你需要
所以如果保留位点就是
------G AATTinsert AATTC-------
------CTTAA insertTTAA G-------
如果不保留位点，就是这样：
------G insert （AATTC）-------
------C（TTAA） insert G-------
（括号里面因为5' chew back，而且insert上的flanking region不带这个“AATT”，
就失去了）
我一般还是选择保留酶切位点，这样的好处是如果这个片段我以后还想用来做别的
我... 阅读全帖 |
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r******g
发帖数: 600 | 49 完全同意，全部买新的，妈的，一个EcoRI expire了，老子clone一个那么简单的
construct折腾了几个月，想着就头大 |
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D***a
发帖数: 516 | 50 从一篇文章上抄来的：
cDNA encoding 'artificial' SUMO-2 'polymers' was generated by ligating PCR
products encoding DeltaN11–SUMO-2 while simultaneously digesting with
restriction enzymes specific for BamHI (N-terminal site) and BglII (C-
terminal site) in T4 DNA ligase buffer, 150 mM NaCl, 0.1 mg ml- 1 BSA at 22
°C for 5 h (enzymes and buffers from New England Biolabs). This created a
range of cDNAs encoding DeltaN11–SUMO-2 cDNA 'monomers' and 'multimers'
that were separated by agarose gel electrophoresis ... 阅读全帖 |
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