n**********g
发帖数: 196 | 1 硫酸铜导致腹泻不是初中化学课上讲的么。。。
另外问题的关键不是实验室的哪个试剂有毒 【至少我是如此】而是默认所有东西（即
使是ddH2O或高纯度NaCl）都是不干净的 都是可能有毒的 自己是绝对不会食用的 也不
会偷偷放到别人食物里让别人食用的 |
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r******y
发帖数: 21907 | 2 他让我们的technician做了太多的研究方面的工作，我们最近一直在做southern，他把很
多工作都交给technician干，从酶切跑胶到转膜杂交显影都包了，当然我也做，我自己的
那部分，可是他给techinician这么多研究方面的工作，弄的technician MM没时间准备实
验试剂，枪头，ddH2O什么的都没弄，害的我得自己干，我觉得这么做不太对，哪儿有给t
echinician这么多研究工作做得呀？偶觉得tech就是帮忙准备东西，灭菌啦，洗瓶子啦什
么的，是不是这样啊？我看别的实验室都是这样的，不过也可能是我们人太少，工作多做
不过来吧，总之我觉得这种安排不是很妥当。而且，老板买了个新电脑，摆在techinicia
n的桌子上，那是让我用不让我用啊，他打我进实验室就说要给我买电脑，现在买了一个
也不说给不给我用，我一直都用自己的laptopa来着，我也不是说要跟他挣，自己的lapto
pa用着也顺手了，东东都在里头，可是也该给偶一个明确的交代吧。一会儿等清闲了跟他
问问去。 |
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n*******e
发帖数: 27 | 5 biz is a master guy on pcr. i have a little to say. i have been using
tail DNA for pcr characterization of mice KO. my experience is that
u should separate all the reagents/pippets/pippetmen from commonly
used stuff. so, first of all, go to clean the pcr station, and make it
as clean as possible. remember, always NOT to bring template to the
station. also, get pcr buffer/ddH2O changed frequently if u question it.
primers should be stocked as 100uM, and u may only aliquot them for use.
use filter |
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M****e
发帖数: 70 | 6 the essential step is to keep everything as clean as possible.
and do not use anything you are suspicious. Ambion is a good
company that has very good experience dealing with RNA. my
personal experience is that: ALWAYS aliquot reagents. i used
to use DEPC'd ddH2O, but now i would rather use commercial
nuclease free water. try to be a quick and clean hand, quick
and dead, you know that? i.e., you quick and RNase dead, no
no vice versa. when you deal with different biological samples,
you have dif |
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r****o
发帖数: 105 | 7
blot stripping buffer:
100mM beta-Mecaptoethanol
2% SDS
625mM Tris.Hcl pH6.8
To make 50 ml stripping buffer:
41.5ml ddH2O
5ml 20% SDS
3.125ml 1M Tris.HCl pH6.8
0.352ml beta-Mecaptoethanol
To use the buffer to strip the blot:
1. incubate the blot in the stripping buffer for
30 min at 70 celcius degree
2. Wash the blot with PBST five times
Note: this protocol's condition is very hars |
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M****e
发帖数: 70 | 8 make sure that you are aware of the buffer effect:
It is estimated that DNA has 15% lower absorbance in TE
buffer, 23% lower in TE+saline compared to water.
1 O.D.260 are 38, 45 and 50 ug/ml for DNA in ddH2O,
TE and TES, respectively. I assume the same for RNA,
and 1 O.D.260 are 40 ug/ml for RNA in TE (from Ambion).
btw, A260/A280 is different for pure RNA
DEPC'd H2O (pH5-6) 1.60
Nuclease free H2O (pH6-7) 1.85
TE (pH8.0) 2.14 |
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k*****o
发帖数: 1486 | 9 离心完倒的时候尽量倒干净.
稍微大点的DNA你只要vac一会儿就可以了,不要让它completely dry,反正你用的是70%
Ethanol,里面最先出来的都是ethanol,留下的那点儿都是纯水(如果你做70%Ethanol用
的是ddH2O的话).
基本所有对大DNA提取的protocol都是说不要蒸干.不过才16kb的话干了也无所谓,加水
静置overnight自己就融了,不行枪吹打两下就OK了.要是不溶的话就是你DNA提的不纯，
16kbDNA提出来应该很透明，一砣一砣的那些基本是蛋白。
为了看里面酒精是否全部蒸干,可以用直接鼻子上去闻,你可以闻出来有没有酒精的. |
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h*******o
发帖数: 4884 | 10 Unless the antibody comes as lyophilized powder, it is recommended to store
the anitbody in un-diluted aliquots. Diluted antibody is not as stable as
the original stock.
For lyophilized powder, usually add PBS or ddH2O following the product data
sheet, then aliquot for storage. |
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s****2
发帖数: 19 | 11 最近实验不顺到了极至. 做basic PRC扩增一个基因, 只用水做模板也会有特异性的条
带.
目的基因是昆虫发育调控基因,在人体没有同源基因,我不会是污染源.
之前这个基因是扩增了且构建好载体的. 最近总是没有办法重复出来以前的结果,才想
着重新检查下基因表达的.结果,做PCR就是用水做负对照都会有和目的条带差不多大
的条带.
开始以为是被污染了.buffer, Extaq, dNTP 都换了新的,水也是用的新开封的
commercial的ddH2o.结果用水作模板还是有一条漂亮的带.(也试了Gotaq,结果一样)
枪头肯定是新的,后来连枪都洗过了. 也重新去合成了之前那对引物,还是一样负对照有
带.
实在没有办法了, 重新设计了引物,产物也比原来长200bp.
悲催的是, 再次所有东西都换新的以后作PCR,负对照还是有条带,且比原来长200bp.
最后没有办法,都让实验室其他人帮我做,结果一样还是负对照有带.
今天老板让我不要自己再做了,找了专门作分子技师明天帮我做.
版上的各位高人,有人有过这么诡异的经历么,请赐教阿~~~ |
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i*****g
发帖数: 11893 | 12 先gel extraction 纯化了，然后ex-taq 处理，不要加ddH2O，用dNTP， taq 用正常200-300%量
72C 20min 后，过Qiagen spin column，然后立即使用
据说T vector和这种 A-overhang insert都不耐放。 |
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m**********d
发帖数: 137 | 13 IHC及IF显示蛋白A在tumor cell的细胞核里高表达，蛋白A的canonical function是与
蛋白B bind并激活B。一些preliminary data提示蛋白A有新的功能，就是与蛋白C
bind而调控另一个重要的生物过程。
现在需要得到A与C直接作用的证据，下面这个用Dynal magnetic beads做CO-IP的
protocol：
10μl Dynal beads coated with protein A+10μl Dynal beads coated with
protein G each reaction, wash with ice cold PBS plus 5% BSA, three times.
Incubate with antibody against 蛋白A (20μl, approximately 4μg) in 500μl
PBS plus 5%BSA, overnight.
2^106 cells/10cm plate, treatment (which induces A and C interaction while
... 阅读全帖 |
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l*******c
发帖数: 478 | 14 哈哈哈，SHAKURAS你太幽默了！
谢谢楼上大家的鼎力相助哈，太好了，看来我有望解开当年的谜了。
我顺便把酶切的反应量列出来，大家看看。都是FERMENTAS的。
我想问：双酶切对两种酶量的比例有没讲究？
ddH2O 30UL
DNA 7UL
10XTANGO 10UL
BAMH I 2UL
ECOR I 1UL |
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b******n
发帖数: 4225 | 15 防真菌其实注意一下就行了
培养箱中水一定要autoclave过的普通蒸馏水（ddH2O伤仪器）
定期灭菌一下（现在的培养箱一般都有sterilization功能）
（一个好玩的事，有个实验室还有做细菌培养的培养箱长了绿藻……）
戴手套取放细胞
另外一个比较重要的是你们的培养溶液是不是被污染了
DMEM/血清之类的放在冰箱里真菌长得慢，不容易看出来
放37度一培养就疯长
建议抗生素，DMEM和血清都扔掉换新的 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 17 Elute by ddH2O? pH could affect the ratio. So use TE buffer to measure O.D.
again. |
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h*********g
发帖数: 18 | 18 Yes, I eluted by ddH2O. So I should use TE buffer to elude? I will use it to
make RNA. Can I still use the DNA to make RNA? Thanks.
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m*********D
发帖数: 1727 | 19 Yes,the DNA should be fine for transcription template. If you load on a
gel, you may even see ssDNA bands.
Better elude in TE. However if elude in ddH2O, you can add some NaCl
solution to 100 mM.this helps to form dsDNA. |
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l*****7
发帖数: 8463 | 20 主要是跑的快，减少了diffusion吧。
适当的点压，band不会变窄的。
其实loading非常简单：
如果用同一条件提取蛋白,
以最低蛋白浓度的样品为基准，用等量的loading buffer(2x loading buffer)，再用
auto cleaved ddH2O (当然你也可以用你的protein样品的buffer)调节其它样品的走胶
液总量。每个lane加入等容量，等蛋白的走胶液。
比如你要load 10 μl（10 μg 蛋白）走胶液，你就要配15－20 μl 的走胶液。
我跑的蛋白胶做western都是直线状或很细的直带状，偶尔会像新月状
这都是几十年前的老方法啦。
我作时， 基本只load 2.5－5 μg总蛋白(混合蛋白, 比如从细胞提取的,或细胞核提取
的）／lane, 你若用纯的， 单一蛋白，用量要减很多。 |
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m******g
发帖数: 91 | 21 To go further, I think if you can do the followiing exp.s:
1) just heat FeSO4, w/o other salines
2) try other source FeSO4 products (not the same company)
3) try other water (ddH2O, and autoclaved)
4) Cool down the sol. and see if the color will come back to green
5) try diff. Conc. FeSO4, diff. Heating Temp., draw a O.D. curve and see if
there is any dose- or temp- dependent relations
etc. and see |
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