f******l
发帖数: 101 | 1 呵呵，谢谢，梦里的情形估计是不可能出现的。
我现在最怕的就是自己拿着plate不小心打翻在地上或者身上。因为每次handle的
plates实在太多了。
怀孕以后有的时候会忽然头晕一下。 |
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H****H
发帖数: 11039 | 2 没用过这个，以前用adeno-associate，安全得多，都不要防护。 |
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e******l
发帖数: 1416 | 3 我两次怀孕都用了，还接触的挺多的。我觉得只能你自己小心点。目前ms没有根据说孕
妇一定要远离这个。 |
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x*******e
发帖数: 111 | 4 Agree, and Ad is DNA virus without envelope, usually is E1/E3-deleted as a
vector. I suggest you should leave away from it.
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看你们有没有自己插入什么基因，本身病毒是没有问题，但大多数实验室用来携带基因
,这些基因会有问题。
但学校不会管，因为危害是理论上，实际不好界定。你自己小心就是了，不要闹到老板
那里，找不必要的麻烦。 |
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m****M
发帖数: 360 | 5 谁有shRNA Screening的经验，给参谋一下。
涉及到的问题
１。同一个老鼠基因的SHRNA是否在所有组织的细胞中KNOCKDOWN效率都是一样的？
２。什么病毒的侵染效率最高？Lentivirus还是Adenovirus?
本人想screen一个老鼠基因的shRNA，从５个shRNA中找到knockdown效率最高的一个shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病毒去侵染我最后的细胞系。为了偷懒，不想把５个shRNA都做成病毒，请问此方法是否可行？有没有这样做的大狭？
谢谢。 |
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m****M
发帖数: 360 | 6 谁有shRNA Screening的经验，给参谋一下。
涉及到的问题
１。同一个老鼠基因的SHRNA是否在所有组织的细胞中KNOCKDOWN效率都是一样的？
２。什么病毒的侵染效率最高？Lentivirus还是Adenovirus?
本人想screen一个老鼠基因的shRNA，从５个shRNA中找到knockdown效率最高的一个shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病毒去侵染我最后的细胞系。为了偷懒，不想把５个shRNA都做成病毒，请问此方法是否可行？有没有这样做的大狭？
谢谢。 |
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l********g
发帖数: 19 | 7 不是有Adenovirus只在p53缺陷的细胞里复制吗？用这样一个Ad mutant表达TK，再用
gancyclovir杀死细胞，还说得过去。 |
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o**i
发帖数: 1165 | 8 go ahead, low MOI is fine |
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l**********1
发帖数: 5204 | 9 Under stress likes Tumor
Please go to
Title:
Potent antitumor activity in experimental hepatocellular carcinoma by
adenovirus-mediated coexpression of TRAIL and shRNA against COX-2. |
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F*Q
发帖数: 3259 | 10 中医的以毒攻毒在治疗癌症方面的应用！
From New York Times
Viruses Recruited as Killers of Tumors
By RACHEL NUWER
Published: March 19, 2012
THE HYPOTHESIS
Viruses can be designed to attack tumors.
THE INVESTIGATORS
Dr. Robert Martuza, Harvard Medical School; Dr. Bernard Roizman, University
of Chicago; Dr. Ian Mohr, New York University.
In 1951, a 4-year-old boy with leukemia contracted chickenpox. His liver and
spleen, swollen by the cancer, soon returned to normal, and his elevated
blood cell count fell to that of... 阅读全帖 |
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w***a
发帖数: 4361 | 11 不是这个field的，不过很好奇这个gene therapy怎么就coming back了？
安全性的问题解决了么？这帮人不是还在用病毒忽悠嘛，adenovirus不行就换AAV之类
的。
still
back
go |
|
n********k
发帖数: 2818 | 12 Well, it shall be that gene therapy never really went away...the safety
concern was grossly exaggerated due to that unfortunately incident and as a
result, the entire field has been set back at least 10 ys if not more...
otherwise I would imagine some would have reached clinics or get close...
Frankly, scientifically some of the gene therapy things are so much more
sound than stem cell therapy commonly practiced in China now...And in some
cases, I would feel comfortable/justified to allow some p... 阅读全帖 |
|
w***a
发帖数: 4361 | 13 Yeah,I have very limited experiences in using virus as a gene transfer tool.
I used adenovirus to infect mouse a while ago and it was disaster to the liv
er. Later, I tried AAV8; the mice were better but with much lower efficiency
of gene transfer.
I heard that random integration of AAV DNA into host genome, though occurs a
t low frequency, is still detectable. Is that a problem?
a
apparently |
|
j******i
发帖数: 939 | 14 很多人对gene therapy谈虎色变 因为十年前的事故 其实就两起嘛 一起是美国的一个
男孩因为adenovirus 引起自身强烈的免疫反应 死掉了 这个叫做Anti virus immune
response
还有就是 欧洲retrovirus 治疗免疫缺陷症（气泡男孩？）大概十个里边3个病人引发
了白血病 因为retrovirus刚好插入到癌基因边上去了 这个叫做insertional
mutagenesis
这两个问题经过十来年的研究 不能说完全解决 但是可以说成就很大
比如说 insertional mutagenesis 现在都可以用 ZFN/TALEN 定点插入外援基因了 或
者直接修复突变的那个基因 |
|
w***a
发帖数: 4361 | 15 不是这个field的，不过很好奇这个gene therapy怎么就coming back了？
安全性的问题解决了么？这帮人不是还在用病毒忽悠嘛，adenovirus不行就换AAV之类
的。
still
back
go |
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n********k
发帖数: 2818 | 16 Well, it shall be that gene therapy never really went away...the safety
concern was grossly exaggerated due to that unfortunately incident and as a
result, the entire field has been set back at least 10 ys if not more...
otherwise I would imagine some would have reached clinics or get close...
Frankly, scientifically some of the gene therapy things are so much more
sound than stem cell therapy commonly practiced in China now...And in some
cases, I would feel comfortable/justified to allow some p... 阅读全帖 |
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w***a
发帖数: 4361 | 17 Yeah,I have very limited experiences in using virus as a gene transfer tool.
I used adenovirus to infect mouse a while ago and it was disaster to the liv
er. Later, I tried AAV8; the mice were better but with much lower efficiency
of gene transfer.
I heard that random integration of AAV DNA into host genome, though occurs a
t low frequency, is still detectable. Is that a problem?
a
apparently |
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j******i
发帖数: 939 | 18 很多人对gene therapy谈虎色变 因为十年前的事故 其实就两起嘛 一起是美国的一个
男孩因为adenovirus 引起自身强烈的免疫反应 死掉了 这个叫做Anti virus immune
response
还有就是 欧洲retrovirus 治疗免疫缺陷症（气泡男孩？）大概十个里边3个病人引发
了白血病 因为retrovirus刚好插入到癌基因边上去了 这个叫做insertional
mutagenesis
这两个问题经过十来年的研究 不能说完全解决 但是可以说成就很大
比如说 insertional mutagenesis 现在都可以用 ZFN/TALEN 定点插入外援基因了 或
者直接修复突变的那个基因 |
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w*****t
发帖数: 179 | 20 Hi, guys, I am looking for some paper review opportunitis for my green card
application, I can not wait for the NIW because my wife will graduate soon.
Anybody has any information, please let me know. Before I am working on the
major of virus, I have some research experience with bacteria and virus
invasion mechanism, gene therapy (adenovirus, AAV deliver system). I used a
lot of bio-techs such as different methods of detecting proteinn-protein
interaction, yease-two-hybrid, phage display, prote... 阅读全帖 |
|
E****A
发帖数: 184 | 21 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12747555
Curr Top Microbiol Immunol. 2003;272:331-64.
Adenovirus interaction with its cellular receptor CAR.
Howitt J, Anderson CW, Freimuth P.
Source
Biology Department, Brookhaven National Laboratory, Upton, NY 11973, USA.
plz send it to e****[email protected] or sendspace or rapidshare!
thanks a lot! |
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d****h
发帖数: 46 | 22 恰巧对病毒-受体有所研究，我也评论两句：
乙肝受体的生物学意义在于：
（1）自从Frank Chisari建立HBV转基因小鼠，HBV研究就没有大的进展。根本原因就是
没有一个有效的HBV体外培养系统。 文辉的发现有助于建立HBV动物模型（参看HCV的小
鼠模型）和感染系统。
（2）HBV动物模型（参看HCV的小鼠模型）和感染系统的建立有助于发现调节HBV复制和
免疫损伤的关键分子，
（3）HBV动物模型（参看HCV的小鼠模型）和感染系统的建立有助于药物筛选
（4）中国有上亿的HBV感染病例，中国人民将或多或少受益于这项研究
但是也不要盲目夸大乙肝受体对于治疗乙肝作用。
（1）绝大多数病毒用多个受体来感染同一个细胞（例如HCV)，也可以用不同的受体感
染不同的细胞（例如Adenovirus)。也有病毒并不依赖特定的受体感染细胞（例如VSV）
。我相信science不接受这篇文章主要是因为很难证明李发现的受体是HBV真正的唯一的
受体。
（2）靶向病毒-受体的疗法还从没有成功过（当然也不能排除HBV会是个特例，但是几
率很小）。第一个例子是SDF和可溶性CD4都不能有效阻断HIV的感染。... 阅读全帖 |
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d****h
发帖数: 46 | 23 恰巧对病毒-受体有所研究，我也评论两句：
乙肝受体的生物学意义在于：
（1）自从Frank Chisari建立HBV转基因小鼠，HBV研究就没有大的进展。根本原因就是
没有一个有效的HBV体外培养系统。 文辉的发现有助于建立HBV动物模型（参看HCV的小
鼠模型）和感染系统。
（2）HBV动物模型（参看HCV的小鼠模型）和感染系统的建立有助于发现调节HBV复制和
免疫损伤的关键分子，
（3）HBV动物模型（参看HCV的小鼠模型）和感染系统的建立有助于药物筛选
（4）中国有上亿的HBV感染病例，中国人民将或多或少受益于这项研究
但是也不要盲目夸大乙肝受体对于治疗乙肝作用。
（1）绝大多数病毒用多个受体来感染同一个细胞（例如HCV)，也可以用不同的受体感
染不同的细胞（例如Adenovirus)。也有病毒并不依赖特定的受体感染细胞（例如VSV）
。我相信science不接受这篇文章主要是因为很难证明李发现的受体是HBV真正的唯一的
受体。
（2）靶向病毒-受体的疗法还从没有成功过（当然也不能排除HBV会是个特例，但是几
率很小）。第一个例子是SDF和可溶性CD4都不能有效阻断HIV的感染。... 阅读全帖 |
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R******n
发帖数: 33 | 24 看到很多用aav-albumin启动子，但也看到一部分人用adenovirus-cmv的，不知道到时
候会不会被批判，有没有有经验的dx指点一下 |
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w***a
发帖数: 4361 | 25 这两个研究可能并不矛盾。
PNAS paper如果用的是adenovirus在liver里面过表达ANGPTL8，
那应该只能是短时间的treatment，比如说一周之内，超过这个时间，老鼠就差不多因为
肝炎要开始挂了。
这么短的时间，beta细胞增殖可能还没完成，所以plasma insulin或者glucose都还看不
到变化。
plasma |
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f**********r
发帖数: 18251 | 27 Immunologist (Seattle)
Etubics Corporation is a bio-pharmaceutical company with a proprietary
vaccine
platform the Etubics Platform, which is stealth to the immune system and has
the ability
to deliver a long lasting "active" immune response against cancer and
infectious
disease targets. We are looking to add a Immunologist to our research and
development team. The successful candidate must have a Ph.D. in Immunology,
Microbiology, Molecular biology or similar. This is a full-time, salaried
posi... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 28 有没有人做过相关的比较？哪个病毒载体在感染细胞之后表达得比较快，哪个比较慢？
我的印象中好像是Lentivirus最慢，但是我没有看过相关文献不知道是不是对的。
谢谢！ |
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z********8
发帖数: 818 | 29
a good question. 但是我更想知道如果选择应用这些virus，他们的区别是什么。 |
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S*********s
发帖数: 304 | 30 用过lenti/retro
感觉表达差不多，基本要2-3天。
lenti titer比较高 > retro.
两者包装的片段大小都有限，<80KD, 再大一点的蛋白对病毒滴度影响很大，一般需要
浓缩。
retro 较 lenti安全一些。包装retro的时候可以选择pCL-Eco, pCL-Ampho,etc等
不同的外壳蛋白。pCL-Eco只能介导感染mouse cell,在做oncongene的时候尤为重要。
你不希望用个EGFR mutant or K-Ras mutant的lentivirus 去感染你的小鼠or细胞，一
旦泄露，有oncogenesis的风险。
另外retro只感染分裂的细胞，生长很慢的细胞用retro感染效率很低。
另外从整合到基因组上的位点来看，lenti有 hotspot，retro更倾向于插入
transcription active的region。所以很多random mutagenesis是retro based的。
Adeno没用过，据说插入基因的size可以更大，但做载体比较麻烦,没经验。 |
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c******r
发帖数: 3778 | 31 兄弟总结得真好，非常感谢！
还真没注意这个表达快慢的问题。Adeno的好处是titer可以非常高，比retro要高不少
。而且也比较安全，即使感染人也没什么大问题。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 32 Why not try combination of transposon and adenoviral and lentiviral vector
just 1-2 days,
Zhang W et al., (2013).
Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic
integration for stable transgene expression
in human cells.
PLoS One. 8: e76771.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24116154 |
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s******y
发帖数: 28562 | 33 谢谢总结！
另外，这个快慢的问题对我们还是很重要的，因为有些细胞只能养三四天，如果用
lenti的话等表达出来的时候细胞已经不行了。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 34 Fig 3 from LXX that Plos One paper,
vector
somatic |
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l**********1
发帖数: 5204 | 36 that slide ppt file didn’t include after 2010 fall to now papers,
pls check,
200 times of ordinary retroviral vector that High-titre retroviral vector
system
Wu C, Lu Y.
High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human
and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages.
J Gen Virol. 2010 Aug;91: 1909-18.
Abstract
Genetically modified cells of haematopoietic and lymphocytic lineages could
provide potentially curative treatments for a wide range of inherited and
... 阅读全帖 |
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a****d
发帖数: 1919 | 37 个人经验， lentivirus （ubiqutin promoter） 感染的细胞，12小时后可以看到eGFP
表达。 CAG-CMV promoter based lenti也能很快看到外源基因表达。
我培养的原代细胞，D0用lenti处理，D3 固定染色，没有问题。 |
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g*********3
发帖数: 177 | 39 这个还真没有关注过，一般在70%左右transfect细胞，然后48hr后收细胞，这时候细胞
已经非常confluent了。不知道有没可能蛋白被细胞讲解。 |
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j******i
发帖数: 939 | 40 快慢很重要的话 那直接转蛋白好了 我在做用lenti直接装蛋白的技术 半个小时就能进
到细胞里边 half-life的话看蛋白本身 |
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s******y
发帖数: 28562 | 42 能不能给个文献？这个技术好用么？是不是什么蛋白都能装进去？ |
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j******i
发帖数: 939 | 43 我们的文章投在Nucleic Acids Research 还没有见刊
我不知道能不能在这里贴摘要 还是把摘要发给你吧 我们装过一些gene editing的酶
有成功的也有失败的 我们的经验是只要蛋白不超过100kd 包装效率还是很高的 |
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s******y
发帖数: 28562 | 45 谢谢！看到了你发的信了。你们的文章很有趣，应该有一定用处（而且应该可以卖专利
费）。可惜还是不能随便什么蛋白都装。 |
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w********r
发帖数: 1431 | 46 adeno很快，infect之后24小时之内就可以看见GFP表达了。 |
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K**R
发帖数: 193 | 47 我觉得adeno 快些吧，lenti 咋说还的整合到chromosome里。 另外应该是lenti，比
如retro安全吧，可能titration低一点？ lenti是retro 替换性产品，应为我当时当
销售买过的。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 48 谢谢！Lenti比retro 安全一点点而已（致癌性不强）。替代的主要原因应该是因为
Lenti可以感染不分裂的细胞吧？ |
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D*******D
发帖数: 100 | 49 我的经验adeno是第二天就能看到不错的GFP了，lenti也不是很慢但是GFP上升趋势缓慢
。 |
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j******i
发帖数: 939 | 50 基因治疗上lenti取代retro是个趋势 最主要的是安全性 因为retro偏向查到
regulatory region 因此激活癌基因的可能性大 所有的retro引起白血病的例子就是这
个原因 而lenti喜欢查到基因里边 因而激活癌基因的风险小 当然随之而来的是打乱基
因正常的splicing 目前基因治疗还没有lenti引起白血病的例子 |
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