k****l
发帖数: 279 | 1 目的带多长，质粒多长？
如果是100bp比10kb，那是小很多 |
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q*c
发帖数: 9453 | 2 同学， 你这些早有人搞， 叫做遗传算法....比你这个简单实验高明多了。
穷举 10000 个二进制代码， 呵呵， 就是 2 的 10000 次方。 同学数学不行啊。
2^10000...你知道这是啥概念嘛。 恩？ ( 10000 机器码也就 10kB 大小量级,
很小很小的程序 )。 2^10000 ~= 2^3^3000 ~= 10 ^3000
10^3000 次方， 10 后面 3000 个零， 这么多个实验程序.....
能把这些程序装下的硬盘， 这个宇宙都装不下。 假设这个宇宙每一个夸克每次
震动一次就算一次计算， 全宇宙从产生到今天， 也没有 10^100 次计算。
。。。10^3000 知道有多大了吧。 其实你还是不知道， 当然我也无法理解这样的大数。 |
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c****l
发帖数: 1086 | 3 同学不知道你从我的帖子的那里看出来我的数学不行了，穷举
0,1 是 2^10000我还不知道吗，我也说了除非你有足够强大
的计算机，看不懂吗？
单实验高明多了。
次方。 同学数学不行啊。
器码也就 10kB 大小量级,
^3000
程序.....
宇宙每一个夸克每次
10^100 次计算。
当然我也无法理解这样的大数。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 4 不管是什么病毒，作为载体，都是用来介导gene delivery，把目标gene靶向靶细胞，
包装的显然是核酸不是蛋白。
慢病毒作为载体，你的目的基因整合到靶细胞的基因组然后再表达，stable
expression.
病毒不是无限大，自然也不可能无限大，就有一个包装能力的问题，天然HIV 9kb多吧
，作为载体包装极限也就是10kb的样子，再大病毒capsid里就放不下了，前面那个哥们
已经说的很清楚了，序列越长，包装效率越差，病毒产量越低。
你这里的基本概念，很混乱啊 |
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i*****i
发帖数: 154 | 5 包装入病毒的是3LTR和5LTR之间，含有packaging sequence的那一段，除此之外的序列
是不会包进病毒的，例如神马氨苄抗性基因，puc ori等东西。所以计算的时候要扣除
这些东西。整个质粒10kb，包装的RNA估计8K左右（去掉2k的零碎）。所以应该没有什
么问题。Open biosystem的pTripz shRNA的质粒有13K，照样包装。 |
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e****p
发帖数: 354 | 6 请教大虾 有一堆EST 怎么分析ALTERNATIVE SPLICING 的可能
模板GENOME上都是GAP，CDNA只是预测的，基因>10KB，
对生物信息学不是很懂， 有什么软件可以用吗
多谢！ |
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x********u
发帖数: 430 | 7 Is it possible that I insert a 6Kb fragment into a 8Kb vector? I have
repeated three times and have no luck geting any colonies. For construct
below 10Kb, I am very confident (>80%) and I can always get the right
transformants after screening. Is there any tricks for this big fragment
cloning? I know all my gene can be functionally expressed in E coli, so
there is no protein toxicity issue. |
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Z******5
发帖数: 435 | 8 pll3.7通常是用来表达miRNA或者shRNA的。
最近想构建一个表达蛋白的载体，但是手上只有这套病毒系统。想问问：
1，有没有人用过这套系统表达蛋白？
2，mU6启动子应该是不能用吧，是不是要用CMV启动子，和GFP做融合表达？
3，我要表达的是一个转录因子，担心与GFP融合会影响其功能。考虑将 CMV+GFP 这段
用 CMV+外源基因+IRES+EGFP+SV40 polyA 替换掉，这样构建好的载体就有近10kb了，
会不会影响病毒包装效率？
另外再问一个我要过表达的是一个原癌基因，在安全性方面是不是要非常小心？ |
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r***e
发帖数: 2539 | 9 10kb是载体大小吧，病毒RNA没这么大。
你的设计没问题，注意不能有polyA signal。
会终止病毒RNA。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 11 phusion
当年实验室一共三种酶
home-made Taq: 做colony PCR筛选用
phusion：做clone，尤其是大片段，那个省时间啊
Plantium HIFI：phusion不work的时候用，比如bisulfite PCR |
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f****e
发帖数: 679 | 12 2nd this. The amplification efficiency of Taq drops sharply when the
amplified fragment is more than 6-7 kb. Phusion works ok for 10 kb, plus it
is fast, saves a lot of time. |
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w*****g
发帖数: 95 | 13 我实验室用PfuUltra high-fidelity DNA polymerase做mutagensis, 也是长片段pcr的
一个选择。phusion的确是快，原来两天活可以并一天了！ |
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q**********0
发帖数: 335 | 14 Thanks for the above sharing. Not sure how high the incorporate error rate
of phusion or PfuUltra high-fidelity DNA polymerase. Do both of them have
high-fidelity amplification? Thanks. |
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q**********0
发帖数: 335 | 15 Which company's phusion is better, Thermo Scientific or New England Biolab?
Thanks. |
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s******s
发帖数: 13035 | 16 pfu和phusion hifi都高保，但是pfu这玩意儿真是很难用啊 |
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s******s
发帖数: 13035 | 17 只用过thermo的，neb也出phusion了？
? |
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q**********0
发帖数: 335 | 18 Yes, NEB also has phusion, but they said theirs is from thermo. |
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j****x
发帖数: 1704 | 19 Phusion是Finnzymes的专利，以前一直是通过NEB代售。去年Thermo把Finnzymes给并购
了，所以后来NEB就推出了自己山寨版Q5。
BTW，NEB自己也产phusion。现在NEB还在买的phusion基本都是自产的了 |
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F*K
发帖数: 608 | 20 用PCR做点突变受质粒长度限制吗？
以前做7kb(基因＋载体）点突变很容易
但最近做一个10kb的质粒突变一直不成功。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 21 做过10kb的质粒点突变，赶进度做得不算很精细
土法上马
自己买的PfuUltra II HotStart Fusion DNA Polymerase(stratagene)和DpnI（NEB）
6个clone中2个成功突变了 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 23 模版是什么？
cDNA？
细菌gDNA?
人／老鼠gDNA?
用过takara的LA(long and accurate)
扩～12kb，细菌gDNA
然后TOPO blunt end
测序，20个里面拿到一个全长都正确的
不过这是几年前
现在不知道哪一家long amplification做得最好
虽然每家都说自己的最好LOL |
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n*****k
发帖数: 69 | 24 多谢回复，模版是human genomic DNA |
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b******n
发帖数: 4225 | 26 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase
这个是stratagene用来做site-direct mutagenesis kit里面的
号称可以扩增20kb
我们一直用这个做高保真扩展，效果很不错
你有钱就多买几个DNA polymerase来试试 |
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u*********1
发帖数: 2518 | 27 为啥中国人没优势？
中国人的数学好，我看bioinformatis一堆堆的中国人。。。
另外关于算法和分析，我觉得这个竞争才超激烈；比如structural variants，本身受
到100bp short reads的限制，所以你再怎么改进算法还是没用。所以那些真正聪明的
搞methodology的比如heng li这样的肯定早就设计比如pacbio这种5kb，10kb的reads的
algorithm了。
不过很同意的是，大部分我们这种半路出家的数学计算机都是半吊子，做不过人家专门
的搞algorithm的
所以我是感觉搞bioinform的一定要对sequencing技术本身超级关注。
其实都是技术技术技术技术技术技术技术技术。。。。。
有了独门技术，才能走遍天下，称霸武林。。。。 |
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S*******r
发帖数: 530 | 28 我连过10kb的片段，invitrogen有一种专门的感受态用于大片段，电转可能好一点，多
做一些连接梯度。
8482; |
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n****3
发帖数: 543 | 29 如题， 版上有经验的朋友介绍一下，我看了许多kit只说最大10kb，没有更大的 |
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s******s
发帖数: 13035 | 30 其实以前做bac大抽的时候也就是用普通kit, 但是有一两个条件和buffer要改变一小点
。估计大多数10kb的kit都可以改造，如果你经常用的话，可以试一下 |
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u*********1
发帖数: 2518 | 31 mrFAST/mrsFAST,是alignment工具，对应的是BWA/Bowtie，
mrFAST得到的alignment的文件基础上，Eichler group又开发出一套基于各种metrics
的软件，比如你说的readdepth的叫MRCaNaVar，对应BWA系列的CNVnator
combine的问题，其实我是最弱智的，就是分别call，然后bedtools找overlap
我现在能做的也就这么多；有的人会在这个基础之上做local assembly
当然了，也有一些软件，会基于两种三种signal来找calling，比如Genome STRiP啦，
DELLY啦；但我感觉效果都差不多；只要read length不增长，不管你如何玩弄program
的花样这个领域还是没有长足进展
我的principle是，我只需要找罕见的SV，而不是optimally的找所有的SV;比如一个疾
病是由一个obvious的罕见的10kb的deletion造成的，我相信combine以上几个signal肯
定可以找到 |
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l**d
发帖数: 472 | 32 你想一下吧，你每天吃进去多少大米、猪肉，要是大米、猪肉里的基因还能保持完整的
话，你的身体里该有多少大米和猪的基因了？当然外源DNA绝大部分被消化分解成很小
的吸收基本单位了。
大米基因组大概有430 million base pairs，人工加入的基因片段再往多里算，算它
10kb，1 X 10 ^4/430 X 10 ^6。也就是说，再多算，转基因片段也就占百分之0.0023。
这百分之0.0023也绝大部分消化分解成很小的吸收基本单位了。 |
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x*****e
发帖数: 309 | 33 看来做cloning 的人还真不少，其实我建议不要纠结于连接了。设计PCR得到5+5=10kb
的片段，注意设计引物的时候5端磷酸化修饰，然后直接T4 ligase连接 10 kb的片段，
相当于自连，容易很多，PCR酶可以用NEB的fusion，说明书上说可以扩增22kb的片段。 |
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m******g
发帖数: 467 | 34 Nature 13.11.14
推荐：
1. A high-resolution map of the three-dimensional chromatin interactome in
human cells
3C方法（你知道4C,5C等等吗）determined over one million long-range chromatin
interactions at 5-10kb resolution.
知道有这么个资源就好，好像有不少类似产数据的paper,但是感觉physically close离
function还是有很长的距离要走（特别是本来就是连锁在一起的gene），加油~
稍微了解一下：
1. Dedifferentiation of committed epithelial cells into stem cells in vivo
看一下标题，知道有这件事情就好啦
2. RNA catalyses nuclear pre-mRNA splicing
The spliceosome is shown to catalyse splicing through th... 阅读全帖 |
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m******g
发帖数: 467 | 35 Nature 13.11.14
推荐：
1. A high-resolution map of the three-dimensional chromatin interactome in
human cells
3C方法（你知道4C,5C等等吗）determined over one million long-range chromatin
interactions at 5-10kb resolution.
知道有这么个资源就好，好像有不少类似产数据的paper,但是感觉physically close离
function还是有很长的距离要走（特别是本来就是连锁在一起的gene），加油~
稍微了解一下：
1. Dedifferentiation of committed epithelial cells into stem cells in vivo
看一下标题，知道有这件事情就好啦
2. RNA catalyses nuclear pre-mRNA splicing
The spliceosome is shown to catalyse splicing through th... 阅读全帖 |
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A*****7
发帖数: 197 | 36 想转入hep2 cells， try 了好几个transfection reagents:lip2000, fugene, 效果都
不好。 哪位朋友推荐一个好的转化试剂？ 谢谢！ |
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s*******m
发帖数: 24 | 39 Try 3min/kb extension time. Worked for >10kb plasmids for me every time.
Also double check your primers... |
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C*******e
发帖数: 4348 | 40 我会试试用3min/kb
请问你用10kb质粒的时候，50 ul体系用多少模板呢？
引物浓度多少？
谢谢！ |
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H*******i
发帖数: 196 | 41 如果PCR work（如果你不担心突变的话）就没问题。没有条带得话基本不用转化，直接
换方法
我弄过比较难的是一个10kb质粒里面有两段500bp（共2000bp）反向互补，最后中间找
了个酶分开PCR 连起来的。
关于PCR, 引物不要用完全反向互补序列，如果做deletion，保证5'端不会misanealing
（里面有很多问题，具体和高保真酶的外切酶活性有关）
时间和你的酶有关，Q5我最长1min/KB
个人引物设计退火温度都是65往上的（你非特异性条带多，是不是序列中二级结构很多
？）。。
另外有protocol是完全不overlap， 引物磷酸化，最后连接的，我没试过。 |
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l**********k
发帖数: 189 | 42 你是说插入片段吗？ 还是整个打靶载体？ 如果是插入片段，常规的应该10kb或以下。
如果是整个打靶载体，因为可以BAC重组，可以做很大，甚至一两百kb。
客户在我们这里做老鼠，属于定制服务。所有知识产权都是客户的。我们也不可以泄露
任何信息。 |
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z*t
发帖数: 863 | 43 大家知道MSCV最大可以deliver多大的片段（包括两侧LTR）？查了下MSCV的原始基因组
大概是7-10kb,我们想clone一个5.5kb左右的片段到MSCV-GFP载体里，不知道这个size
是否会影响病毒包装侵染的效率？ |
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z*t
发帖数: 863 | 45 你是说这段么“A disadvantage of this type of double-copy vector is that the
RNA form of the vector genome contains two copies of the cDNA, and since the
size of the vector RNA is limited to about 10 kb, the size of the cDNA that
can be accommodated is about half of that possible in other retroviral
vectors.”
好像说的是因为retrovirus要搞two copy of RNA，而two copy加起来的总共最多可以
装10kb，所以单个cDNA不能超过5kb?
不知道目前的MSCV-GFP/neo是不是这种double copy vector
kB. |
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x******o
发帖数: 76 | 46 试过DH5a也做不出来，而且DH5a难道不是不适合做unstable clone吗？
我觉得主要问题可能是LTR之间片段丢失，所以总是得到小片段的质粒（2kb）。
我的LTR之间有10kb长，是不是太大了？ |
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Z******5
发帖数: 435 | 47 用invitrogen的这个kit
5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, version 2.0
说明书上说貌似50min反转录4kb没问题。 我之前做大约10kb的，反转录2个小时，结果
很好。 不过我那个基因表达丰度非常高。如果表达丰度很低的，不知道效果会如何。
另外，建议在预测的TSS后面1-2kb的地方同时设计一个引物做5'RACE， 看看和你从
11kb的位置拉出来的是不是同一个起始位点。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 48 你们DNA胶回收都用的什么kit啊？效率如何？
我需要回收的DNA size在3-10kb间。我酶切2ug，跑胶（1%）回收。切下来胶质量大概1
00~200mg。
实验室有QIAGEN的kits。我试了QIAquick（旧kit），完全回收不了DNA。QIAEX II（全
新kit） 大概能回收500~800ng。根本达不到说明书上说的recovery rate。这属于正常
情况吗？
在网上搜了下，貌似QIAGEN的胶回收产品口碑不太好。我现在打算试试其他公司的产品
，希望找到一款简单又省心的产品。请克隆经验丰富的各位推荐一下~ |
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x********e
发帖数: 35261 | 49 你们DNA胶回收都用的什么kit啊？效率如何？
我需要回收的DNA size在3-10kb间。我酶切2ug，跑胶（1%）回收。切下来胶质量大概1
00~200mg。
实验室有QIAGEN的kits。我试了QIAquick（旧kit），完全回收不了DNA。QIAEX II（全
新kit） 大概能回收500~800ng。根本达不到说明书上说的recovery rate。这属于正常
情况吗？
在网上搜了下，貌似QIAGEN的胶回收产品口碑不太好。我现在打算试试其他公司的产品
，希望找到一款简单又省心的产品。请克隆经验丰富的各位推荐一下~ |
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L****T
发帖数: 169 | 50 我的梦想是全基因合成一个10kb以内的质粒成本降到100刀以内，速度和合成引物一样
快。直接在电脑上改个碱基做点突变然后发给公司，第二天快递收到100ug的质粒。哈
哈。 |
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