t*****c
发帖数: 2 | 1 原理上贴壁细胞消化后细胞膜受损，不适宜用Annexin V检测，但我发现有些文献也用
此试剂盒检测贴壁细胞的凋亡情况，困惑中。。。求达人解答，多谢啦！ |
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e**r
发帖数: 1144 | 2 贴壁细胞上做显微注射
多年前用的人很多，现在几乎看不到了
这技术是不是有什么缺陷？
有人现在在用吗？ |
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h********n
发帖数: 4079 | 3 楼主, 我觉得你说得可能是两个问题:
1. 细胞贴壁强弱
2. 细胞贴壁强弱对生长的影响. |
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k***g
发帖数: 4904 | 4 比如说Teflon，PDMS之类非常疏水的材料，没有任何修饰的情况下，好像好多癌细胞也
能贴壁然后生长？但是像玻璃和硅之类的亲水表面，是不是就没那么容易贴壁？这是一
种常见的规律吗？有什么解释么？谢谢大牛指教 |
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j****x
发帖数: 1704 | 5 关于这个问题，刚读研无聊的时候做过不是很严谨的比较，“结论”是和缺氧无关
当时的培养瓶盖还是老式的，不带filter需要自己拧开一个角度的那种，同时养的三种
细胞293/Huh7/Hela，用的invitrogen的普通DMEM培养基，不含hepes。有一次传细胞的
时候没留神盖子全部拧紧，结果第二天发现所有培养基全部变碱，293/Huh7贴壁出现严
重问题，漂浮大量“死细胞”，活细胞形态也非常差。但是Hela没有任何问题，一切正
常。拧开瓶盖之后不到24小时，多数“死细胞”重新贴壁，细胞形态恢复正常，培养基
颜色也回到正常pH范围。这时候我又把瓶盖拧紧，继续培养差不多48小时，所有细胞生
长一切如常，这时候由于细胞已经生长一段时间自然产酸，即便拧紧瓶盖，培养基也不
会变碱的过分。
我的“结论”是，某些细胞（293/Huh7）对培养基pH比较敏感，尤其是在悬浮后等待贴
壁的时候，而有些糙的比如Hela就不敏感，而缺不缺氧，大部分细胞不在乎，尤其是在
短时间内 |
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p******n
发帖数: 330 | 6 有人在养hepG2细胞吗
正在养这个细胞。发现这种细胞很难养，不仅不能单层贴壁，很容易成团生长外，用非
酶消化液（non-enzyme buffer）消化后居然能死一半。由于需要上流式细胞仪，hepG2
又是贴壁细胞，所以必须要detach，但是这个损伤消耗不起呀。而且我的实验是不能用
trypsin来消化细胞，因为trypsin会让我损失一些细胞表面的膜蛋白。我用非酶消化液
消化的时间很短，只有1分钟，消化后立即洗涤，我分别检测了消化后在不同温度下孵
育半小时和一小时，时间没有让细胞死亡率增加，但是温度对其有影响。（我是用PI染
色鉴定细胞死亡的）
有没有同学在养这个细胞，能不能分享一下经验。我的细胞是从ATCC买的，所有的细胞
相关用品，如medium等都是购自ATCC，按其官网上的要求做到。或许有同学的细胞从别
的地方买的，会更好养一些呢。 |
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w********r
发帖数: 1431 | 7 当然可以啊。毒性大可以优化一下转染条件。比如细胞密度，转染前细胞贴壁时间（3-
5小时就可以，有些贴壁细胞太久之后效率会变低）。此外lipo RNAiMAX或者LTX毒性比
2000要小。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 8 如题，谢谢！能在半小时或1小时内贴壁的。
细胞是原代细胞。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 9 如果confluent 就不贴壁的话，有两个可能：
1。mycoplasma contamination
2. cell type transformation
我们是用PCR-based method, 非常简单，
很多公司有卖的，大概就叫 mycoplasma detection kit
没有好办法去除，发现被污染就就整个细胞株都扔了重新在可靠来源买一个。
我当时用这个3T3的时候，试了学校里几个实验室来源的细胞都有污染，
后来干脆从ATCC买了一个新的，反正又不贵 |
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k******y
发帖数: 236 | 10 在贴壁细胞中siRNA了某基因，之后就有大量的碎片漂浮在medium里，镜下看就是小圆
泡，diameter < 10um，而细胞即使trypsin消化下来之后也并不是规则的圆形，这些碎
片并不能uptake trypan blue，计数活细胞(trypan blue-, diameter > 10um) 的数量
有明显减少, 但以trypan blue+ 的％算，并不比对照组减少很多，大概从95％减少到
90％
用FITC-Annexin V和PI double staining，做flow没有看到明显Annexin V+细胞群，
AnnexinV+ PI+细胞群会增加但也不会增加太多(本身％也小于10％)
用50uM Z-VAD-FMK caspase inhibitor 与siRNA共同处理细胞, 这些碎片就不会产生，
计数活细胞的数量也不会减少, 和对照细胞没有差别
请问这是否说明细胞有死亡？能否看出是何种死亡方式？谢谢大家! |
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k***e
发帖数: 41 | 11 消化一次，今早一看，贴壁的长的还好，但是没贴壁的都抱团漂啊～
想用gelatin处理一下皿底，各位有什么建议么？
谢谢先！ |
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w********h
发帖数: 12367 | 12 adhesion strength也是衡量adhesion好坏的一个参数，
离心水流剪切也是一种测量的办法。。。
有的细胞可以不用很强的附着也能照样生长。。。
hydrogel因为表面的hydration layer和比较weak的stiffness，不支持细胞黏附。 |
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s*****g
发帖数: 7857 | 13 这个是Control well的，就是只是change 了media.
--那你的treat换了没有?
我一般是提前一天把细胞设置好,第二天一早加药treat.根本不换media了.不过我的多
是悬浮细胞.
有可能换MEDIA把贴壁细胞给冲悬浮了? |
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p**i
发帖数: 3525 | 14 平时还是很贴壁的，问题在到了confluence之后。
有什么简便的方法检测和去除mycoplasma? |
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r***e
发帖数: 2539 | 15 我用petri dish还是有贴壁发生。
有人推荐我用agar在板上铺一层，效果很好，但是收集细胞不方便，带一坨agar。只能
放弃。
同关注。 |
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c*******r
发帖数: 440 | 16 1. 是不是转染的外源基因片段越小越容易整合？ 多大的片段不容易整合（既极限有多
大）
2. 如何筛选悬浮细胞的稳定表达系？ （用G418） 要挑琼脂糖板吗？ 本人只做过贴壁
细胞的筛选，方法有什么不同？
请做过该实验的多多指导，多谢！ |
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b**********8
发帖数: 349 | 17
2/
这位战友用不着惊讶，因为我们实验室很少handle genomic DNA，所以你说的那些kit
我们确实没有，这次我只有两个sample，就想用传统的蛋白酶K消化酚氯仿抽提得了，
以前做过组织的，现在是培养的贴壁细胞，处理上应该有点差别，而且样品比较宝贵，
所以想搞个可靠地protocol，kit就不考虑了。老板虽然钱不多，但是该买的东西从来
不眨眼的，不过为了两管DNA还要去买个kit，我自己都不好意思开口啊。
另外，有谁知道TNE buffer的配方不？我们组之前的posdoc一直用这个buffer+蛋白酶K
消化细胞，然后直接加饱和氯化钠，离心取上清后用乙醇沉淀。不过最近这个buffer找
不到了，她也没留下配方，网上找了几个貌似差别还蛮大，谁用过的，确实可靠的，甩
一个给我吧，谢了。 |
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k***g
发帖数: 4904 | 18 这个。。我也是觉得Teflon属于非常惰性。。。可是我们实验中用到的Hela和HepG2确
实是长在Teflon PFA microchannel里了，而且PDMS channel更是常用来养细胞，这个
是确实观察到的现象啊。所以我才想问问有什么其他原因没有。
,
Edition, |
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k***g
发帖数: 4904 | 19 另外，好像一般tissue engineering描述adhesion是说detach的难易吧？我们的情况不
同，只要细胞在表面展开，开始生长就行了。我们用Teflon channel的时候，确实是稍
微增加点流速就冲下来了，这是不是就是一般认为的很容易detach？还是说某些癌细胞
比较不挑，怎么都能展开？反过来，在hydrogel上，就真的不展开了。
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Edition, |
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h****n
发帖数: 92 | 21 我原来也遇到过类似问题，基本上就是细胞太多，而且贴壁细胞消化以后可能膜不完整
，更容易成团。有时候固定时间太长也会成团。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 22 这位战友，你早说你就2个样本啊，而且还比较宝贵，那就更应该考虑kit了。不过允许
我嘲笑一下读书读傻了都，呵呵。
最简单的办法，打个电话给公司，直接要一个demo，大部分公司（尤其中小公司）都会
屁颠颠的立即给你寄一个4-10个样左右的demo kit，足够你用的了。而且这种基本试剂
盒原理简单，不存在不同公司效率差别很大的可能，放心使用，比你用传统酚仿抽提肯
定靠谱。
对BTW，于提取基因组DNA，基本上组织样本和培养的贴壁细胞没有本质差别，以前的
protocol都是一致的，现在的kit也都是两者通用。
kit
酶K |
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b******s
发帖数: 5365 | 23 可以，但要很小心操作，特别是容易结团的细胞比如hepG2什么的，另外同时染个PI |
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s******y
发帖数: 28562 | 24 对细胞刺激太强，副作用非常强。
但是最主要的应该是因为没有什么用途了。以前经常是为了注射一些荧光标记的蛋白进
去，后来都有荧光蛋白了，慢慢就没有人用微注射了。 |
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t****p
发帖数: 1504 | 25 生物学中让人头痛的地方就是这种情况，想做定量，但是varyation太大，不知道是否
该相信。
做过一些迁移的实验，多说两句。
1 transwell assay: 细胞状态很重要。你如果是贴壁细胞，trypsinization时间的些
微差别，离心重悬吊强度就有影响。另外我非常怀疑公司的产品是否能够做到不同孔的
膜都做得一样。
2 in vitro wounding assay：就是贴壁细胞划线，然后在特定时间看迁移到细胞所覆
盖的面积。此assay对medium的成分非常灵敏，要严格按照别人的protocol来做。换个
medium结果竟然会相反！你说该信哪个？此assay的定量分析非常耗时。
3 needle assay：就是一个小needle尖头释放chemoattractant，然后用软件实时记录
每个细胞的迁移，运算得到迁移速度和角度。模式生物Dictyostelium做这个assay的时
候需要先polarize才能迁移。很多文章说某个突变体影响力迁移速度。问题是很多突变
体本身它没法被polarized。你说究竟是它的极化能力受到影响还是本身的迁移受到影
响呢？曾经给c... 阅读全帖 |
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l*********2
发帖数: 247 | 26 第一次接触Hybridoma cell。细胞从液氮取出后在70%酒精里融化。培养液加热至37度
，替换冻存液，然后细胞在6孔板中培养。24小时后吸取培养液至2ml tube，10000rpm
离心后复加至细胞。24小时有很多贴壁细胞，48小时观察只有少量贴壁，大部分死掉了。
已重配过培养液，不是培养液的原因。
请问板上高手这是什么原因？谢谢！ |
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d****i
发帖数: 2346 | 27 显微镜底下看也不像是死的，是不是贴壁不牢固？fiberblast细胞贴壁为啥不牢固呢？
做conditioned medium的时候7天后上面漂了一层。。。
请大神指点哈。谢谢了！ |
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b**********8
发帖数: 349 | 28 新手，最近在做一个质粒的稳定转染至肝癌细胞，大概步骤如下，6孔板中转染，24小
时后按1:50的比例传至10cm dish中，（大约1~2万个细胞），再等24小时开始加药筛选
，没隔3天换液维持，至第9天前后开始出现大量细胞死亡，并出现镜下明显可见的
colony，至第12天左右出现肉眼下明显可见的colony，于是用黄色tips直接在肉眼下挑
取单个colony，分别转移至96孔板中培养，并逐渐放大至24孔板，然后进行鉴定。至今
挑了大概40个colony，仅有一个阳性，但是继续放大培养两代后阳性反应突然丢失。
现在我有两个问题,
1）阳性反应突然丢失的原因可能是什么？细胞不纯？阳性细胞被其他细胞取代？筛选
出colony并放大培养的最初几代过程中，是否一定不能中断选择药物？哪怕只有两三天
的中断？
2）在网上翻了些帖子，发现有的人会在挑出单个colony培养贴壁后在做有限稀释，挑
取单克隆，这样做是不是会是拿到真阳性克隆的机会更大？可不可以按照这样的思路来
做，先用我上面的挑取，培养并鉴定出一批（视运气好坏多少不等）有阳性反应的
colony（姑且认定这个colony里面含有我想要... 阅读全帖 |
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y********g
发帖数: 782 | 29 Treat的细胞也是这样子的，好像细胞“漏”了似的~~~
细胞悬浮了会是这样子的吗？悬浮细胞一般都是圆的吧，我的看起来好像还贴壁。
用同一个incubator的女生的细胞没有问题，我Flask里面传代的细胞也没有问题。哎，
纠结死了。。 |
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c**a
发帖数: 94 | 30 384的盘子用CHO做ICW, 种细胞之后和第二天早上都好好的, 到了做serum starve 之后
一看好多细胞被洗掉了,但是奇怪的是正中间的不掉,贴壁一圈不掉,而是周边的细胞都
没了, western染色之后看起来像个'回'字. 具体样子在附件里. 我确定的一点是之后
的treatment 和western步骤并没有显著的让细胞减少, 所以貌似问题在用plain
medium 洗细胞和serum starvation步骤上. 是这样的吗, 怎么避免呢, 洗的时候很
gentle了, 怎么可以更gentle呢? |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 这个很正常，不用担心，
左边的细胞太密了，大部分细胞都被顶起来了，所以成像质量很糟糕。
另外，actin 在组织细胞里面看起来就是和你左边的那个图差不多的，
右边那个里面大部分都是所谓的stress fiber, 是fibroblast这类的贴壁细胞
在培养情况下充分展开后的特定条件下的表型，反而不是正常的组织细胞应该
有的样子。
Bearbaby 说的是对的。 但是你可能是开始接触细胞的人，她说的对于你而言
可能有点太深 ：） |
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k****y
发帖数: 423 | 32 不用过分自责，我怀疑你们实验室的细胞本来就有myco污染，只不过你用的细胞比较敏
感，所以raise the issue,不然说不定都发现不了。很多细胞特别是贴壁细胞的growth
/proliferation 在myco污染之后都没有影响的。再者如果细胞比较难获得，可以不用
扔掉，用mycoplasma removal reagent，比如plasmocin就可以，一般2-3个星期就可以
除掉。以后实验室常备mycoplasma detection kit，隔段时间测一次就行。 |
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e**r
发帖数: 1144 | 33 CHO K1细胞，前一天用150uM H2O2处理过，养了一天，大部分细胞漂起来了，剩下贴壁
的细胞在相差显微镜下看大部分都有两团亮的东西在核的两侧
之前也看到过一次这种东西，那次是因为在DMEM里养了几天，大概是因为没有proline,
所有细胞都变成了这个样子。换成F12养了一天就恢复正常形态了。
谁知道这种亮的东西是什么结构？ 低倍用眼睛看似乎是一些小泡构成的簇
Hela, 293T上没见过这种东西。 |
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n***3
发帖数: 663 | 34 有多少细胞飘着？一般情况下是flask都长满了，没有多余的地方贴壁的情况才会有少
量细胞飘着。
做conditioned medium的时候飘着的细胞应该是BM cells。 我一般在配conditioned
medium以后最后一步过滤一下，去掉floating L929 cell. |
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N******o
发帖数: 3053 | 35 如果你需要细胞密度很高做实验的话，可以先多个Plate养，然后收集起来加到
RetroNectin（Takarabio，Japan)修饰Plate上面。
RetroNectin个破东西超级厉害，当然也是超级贵，你只有用高浓度Trypsin才能剥离细
胞，而且剥离后一定加入PBS冲开细胞，如果你加入培养液，里面的血清中和Trypsin以
后细胞又被RetroNectin粘上去了。 |
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p*****r
发帖数: 64 | 36 多谢大家的建议.
aishang,我目前就想用机器先remove大部分的medium,剩下约8ul的medium (如果剩下的
medium太少的话,机器的tip头就会很容易带走细胞),然后多加一些lysis buffer.虽然
这样lysis buffer被稀释了,但可以试试能不能拿到足够的RNA.
ArtyArty: 我目前用的是Cell to CT kit, 它提供lysis buffer, stop buffer,裂解细
胞后,可以拿到RNA, 然后RT 后拿到cDNA.你能不能告诉我你知道的那个不用提RNA,就可
以做qPCR 的kit吗?十分感谢
smartkevin: 多谢你帮我查的plate, 我先打电话问问corning,看他们的这个plate怎么
work的,希望fit my story
目前这个实验是在broad做的,但broad里的人都用贴壁细胞,这样remove medium的时候,
细胞都不会少,所以他们对我的悬浮细胞也没什么好的建议.
多谢各位了. |
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l*******c
发帖数: 478 | 37 请问：293细胞是T细胞的一种吗？是悬浮生长还是贴壁的？
谢谢！ |
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r******k
发帖数: 446 | 39 最近小弟要culture K562. 以前没杨过悬浮的细胞。大神们给点意见？
1. 复苏以后怎么又贴壁细胞？？？
2. 怎么传代呀。。。离心下来数细胞数？ 那传到25cm dish 和T75的dish都需要seed
多少细胞？ 多久算养好？
谢谢 |
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J*****i
发帖数: 55 | 40 为什么有的细胞可以很容易贴到glass上， 有的却要先coat glass才能贴上去呢？ |
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n********k
发帖数: 2818 | 41 NS should be a lot easier than ES and cheaper too...but for biochemistry, it
is still too expensive...on top of that, the consistency is a bit problem
too as the culture is changing fast...
BTW, by 好养倒是真的。当然贴壁后就容易分化...can you elaborate a bit more on
this? do you use low adherence plate or bacteria dish? what age? Can you
slow it down with growth factors/culture conditions? and how bad the
differentiation could be when 贴壁...I haven't examine this part very
carefully myself but would love to know... 阅读全帖 |
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d******8
发帖数: 1972 | 43 对自己复苏细胞的步骤不放心，昨天来的细胞，先复苏了对照细胞系，今天还没有贴壁
。就想把实验用的细胞系暂时先在干冰和－70冰箱里保存两三天，然后根据对照细胞系再复苏。
不知道在－70度里能不能保存两三天？另外，必须离心，取出冻存液，还是直接加入培
养基也行？谢谢 |
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e**r
发帖数: 1144 | 44 hela
lipo转染后12小时看还是好的
用培养基换掉后又过了12小时，发现大部分细胞都死了，死掉的细胞大部分仍然贴壁保
持梭形，部分漂起来的也是扁平梭形的 |
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d****i
发帖数: 2346 | 45
是贴到培养板子，然后加药，最后再洗。谢谢！cytospin之后细胞就只能做荧光之类的
了。 |
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i*********0
发帖数: 915 | 46 我前一段时间也在用这个phenix细胞，但是没有lz说的飘的情况。我passage这个细胞
一般都是用medium去吹的，不用胰酶消化。 |
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c*****y
发帖数: 35 | 47 自己或托朋友带细胞回国，近两年共6次，都是SFO-PEK， 贴壁细胞于50ml flask灌满
media3次，冻存细胞于干冰foam box中托运行李箱3次，均顺利抵达，没有受到任何海
关检查。至少8今年8月还没问题。其他机场没试过，不敢保证，但认为值得尝试。 |
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l****1
发帖数: 66 | 48
细胞间隙长了一些颗粒状的东西，很小，贴壁长，换液换不走。
细胞生长速度很慢，大概只有正常的1/3。
我还以为这个就是支原体。 |
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l****1
发帖数: 66 | 49
细胞间隙长了一些颗粒状的东西，很小，贴壁长，换液换不走。
细胞生长速度很慢，大概只有正常的1/3。
我还以为这个就是支原体。 |
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p**i
发帖数: 3525 | 50 最近总苦于换medium时细胞被冲起来，多小心都不行。
可以提高coat时的gelatin的浓度吗?
谢谢 |
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