x**2
发帖数: 255 | 1 我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
不是想要的。
请问有什么诀窍么？
谢谢！
我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
ligation |
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x**2
发帖数: 255 | 2 我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
不是想要的。
请问有什么诀窍么？
谢谢！
我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
ligation |
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r****r
发帖数: 379 | 3 一般大片段克隆，会导致连接效率很低，克隆数大大减少，可以看看你的克隆数和你常做的克隆比是不是还比较正常，如果比较正常，那说明这种假阳性很可能是因为你的插入片段有一段序列比较容易发生重组，试着30度长克隆和摇菌看看。另外，能不用单酶切做克隆就不要用，你大片段克隆还用这个策略，最好换其它双酶切。
另外，单就大片段克隆而言，建议用GeneHogs菌株，我手上的片段普遍10k以上，用这个菌株，从来没出现过问题，感受态效率一般7次方就可以了，15kb可以长百来个克隆。
因此建议先更换单酶切策略和换genehogs，然后不行再换30度生长看。30度生长，已发生重组的质粒，一般10个有2个总是对的。
gone
cut |
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y**********o
发帖数: 37 | 4 前面有人提到了你用的两个酶切位点在载体上只隔了一个碱基,这种情况下载体双酶切
效率是很低的.
另外不知道你想加什么Tag到你要表达的蛋白上?如果是常见的FLAG和Myc这些,可以用个
笨点的方法,clontech有很多带Tag的表达载体,先把cDNA插到这些载体上,然后再用另一
对引物PCR扩带有Tag的蛋白序列.如此一来就避开了你的引物过长这个问题.并且只需要
做最常规最简单的克隆,只是在载体和酶切位点的选择上需要多花点时间验证. |
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n****0
发帖数: 696 | 5 为什么单酶切产物比未酶切的质粒对照跑的快呢？双酶切倒是得到了想要的大小的产物
。谢谢。 |
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b*******6
发帖数: 39 | 6 实验的目地是表达和纯化一个蛋白，加入不同的Translocation mitif，使它能够加到
培养基里面能够进入细胞内。
对于下面实验:
1 换引物、突变回去估计不太现实
2 因为出问题总是在Bamh1-Bgl2位点，而载体因为考虑Bamh1星号活性的问题只切了1小
时，所以考虑过夜切；还有考虑毒性问题，降低培养温度。质粒切以后跑胶的时候有一
个问题就是跑得不是很平直，不知道是因为我没有切好还是质粒量太多。
3 请别人做不是没考虑过，但是负责我的那位高年级博士生估计PCR都有问题，因为他
也做过，但是没做下去。长引物容易形成二聚体，我是用Touchdown PCR或者里面加了
甘油才解决问题的。
4 插入的片段很普通，就是600bp左右，关键是要加的tag，3个不同tag，是
translocation motif，加在蛋白上面用于进到细胞里面去的:
TLM 1 (PLSSIFSRIGDP, 12 aa)
CCGCTGAGCAGCATTTTTAGCCGCATTGGCGATCCG
TLM TAT (GRKKRRQRRRPPQ, 13 aa)
GGCAGGAAGAAGCGGAGACAGC... 阅读全帖 |
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g******1
发帖数: 244 | 7 不需要线性化，直接在两头引物加两个位点，PCR以后双酶切，或者末端填平磷酸化自
连转化扩增后再双酶切。LA-taq突变率挺高的，建议phusion。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 8 以前好好的。接着几次跑胶小片段都有点弥散，不知道原因。左图是筛克隆时的双酶切
，质粒是按《分子克隆》的碱裂解法提的。右图借用别的lab的qiagen的试剂盒提的然
后双酶切。问题也可能出在loading dye上。按《分子克隆》配的6X,40% sucrose加上
两种染料。EB是直接加在胶里的。大家看看吧，多谢！ |
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F*****8
发帖数: 243 | 9 双酶切连接载体不是很简单吗？ 难道传统的双酶切连接策略已经过时了吗？
现在有什么更先进的方法？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 10 双酶切能用，但是比较大的问题是
1. 要PCR，引入突变，需要反复测序
2. PCR片段，酶切片段，载体片段需要回收，增加许多step
3. 需要考虑读框，片段越多越复杂。
4. 大规模clone （多种片段进入同一载体，或者同一片段进入多种载体）效率低下。
我三五年前经常做克隆。当时常见的方法就是，凡事能拿到gateway的，统统gateway；
需要改造的，改造部分合成，用gibson assembly， 然后gateway；改造比较多的，全部
合成。
其实生物破刀说工资少，其实每天人工加overhead也要$200。很想不通有些老板就是
愿意让手下多费一个礼拜反复做酶切测序，也不愿意花钱买，或者用gateway。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 11 我倒是不同意楼主说的。我在大学实验室干了20年，我承认最近几年利用的homologous
-recombination方式作克隆的技术我没跟上，老式酶切的还是一把老手。我现在呆的这
个实验室是分子生物学起家，但过去十多年的学生，基本没有作过克隆。作过的几个，
都是最简单的双酶切，一个vector转到另一个，就完事了。往往是找我咨询一下，看看
那个酶合适，实验室有现存的。很多学生走的时候会因为没有作过克隆而遗憾，毕业之
前会找我，从技术上花一两小时，让我讲一下原理和资料。我们上次作CRISPR,实验室
就我能从克隆到细胞，全套熟练。对CRISPR感兴趣的人多，可没有人敢接手。现在一个
在作CRISPR的学生，基本每一步都是我指导的。隔壁实验室的一个博士生在作CRISPR，
也是我帮忙指导克隆方面的技术。。。所以，会作是一个太笼统的说法，精不精差别很
大的。尤其是需要高效率的克隆，如建库，大片断的插入等等，高低手的差别还是有的。
第二个值得考虑的是industry experience。这个在找industry工作的时候还是蛮看重
的。公司对team work的强调比大学厉害得多。我上次在... 阅读全帖 |
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X***n
发帖数: 366 | 12 Sorry啦。SacI和SalI是顺序切的。其实7.5k的那个是SalI和BglII，使双酶切。
我是该保证酶切的质量。谢谢指教！
//bow
(of
just |
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r*****t
发帖数: 4793 | 13 载体和insert的酶切都没问题(insert从别的载体里切出来)
载体6k,insert4.5
连接之后,张的克隆都偏小,挑菌后标准浓度抗生素的培养基养不出来,用30%浓度的抗生
素的培养基可以长,但是提出的质粒都不是,看起来像是双酶切后的载体自连的
失败阿失败
为什么啊为什么 |
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n****0
发帖数: 696 | 14 是啊，按说是环状没被切跑的快啊，我以前做的也是这样的。可是这次我的结果是有一
条非常非常浅的线状大小的条带（可能质粒没提好断开了），还有一条或多条（有点
smear的感觉）跑的很慢的带，但是没有超螺旋那条带（应该跑的比线性的快才对），
这怎么回事呢？我只是做个酶切确定下自己的构建，双酶切倒是也有我的那个大小的片
段。不知道碍不碍事啊？之前subcloning的时候已经sequence过了，再克隆到donor
vector时就不用再sequence了吧？ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 15 看起来你突变后挑菌落做的miniprep量是没问题的，可是size好像差太多了。而且双酶切只有两个酶切位点，和突变之前的质粒差别太大了。我觉得是质粒出错了，会不会转化的时候污染了其他质粒，挑错了菌落。如果miniprep出来的质粒是错的，还用原来的测序引物去测，因为引物不对，当然就测不出来了。
看了一下前面的回复，4楼的同学早就言简意赅的说过了。 |
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b******r
发帖数: 111 | 16 Good idea. My 9kb DNA itself contains too many restriction sites. NotI is
the only choice.
'Description:
Important: GeneHogs® competent cells are being discontinued on December
31, 2007.
Use ElectroMAX™ DH10B™ T1R cells for exceptional performance!
'
常做的克隆比是不是还比较正常，如
果比较正常，那说明这种假阳性很可能是因为你的插入片段有一段序列比较容易发生重
组，试着30度长克隆和摇菌看看。
另外，能不用单酶切做克隆就不要用，你大片段克隆还用这个策略，最好换其它双酶切。
这个菌株，从来没出现过问题，感
受态效率一般7次方就可以了，15kb可以长百来个克隆。
发生重组的质粒，一般10个有2个
总是对的。 |
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H****s
发帖数: 301 | 17 有两个建议：
（1）改双酶切连接为单酶切连接。载体要处理好。
（2）使用DH10B感受态。或者是类似的RecA-菌。
我做的插11kb到5kb的载体上去，基本上都成了。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 18 你的意思是，双酶切载体和插入片段，互补端对T4活性有影响？
不过我以前做单酶切然后去磷酸化，结果无数自连没一个连进去了的，这个怎么搞呢 |
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b******n
发帖数: 4225 | 19 呵呵，那可以这样，先BamHI单酶切连接PCR产物的一部分
（外面的BamHI位点设计成BglII）
然后再MluI和BamHI双酶切连接PCR产物的另外一部分
PCR产物 MluI-BamHI-BglII
先克隆BamHI-BglII片段进入BamHI消化的载体
得到正确克隆之后再克隆MluI-BamHI进去
这个缺点就是没法转移到另外一个载体上去了 |
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s**********a
发帖数: 92 | 20 之前发过相关问题帖子:
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31968723.html
现在正按照大家建议扩一个3kb的promoter， 然后连接到pGL3 or 4。
我的方法：引物两端加酶切位点，外面另有三个保护碱基。
1，Q5扩片段，跑胶证明分子量对，胶回收，双酶切，连接pGL，转化，无克隆。
2，Q5扩片段，Taq加A，连接T载体，转化，无克隆。
3，Taq扩片段，连接T载体，转化，无克隆。
大家帮我分析一下，问题出在哪里。难道是一开始的引物问题么？引物会有什么问题呢？
谢谢大家！ |
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e**e
发帖数: 166 | 21 25个克隆 最后一个总是有问题 不是突变就是空质粒。
问一下 KapI BamHI双酶切的质粒可以冻在－20 反复用吗？好像旧的很容易自连。
另外， KOD 和Phusion总有突变。 大家还有更好的Taq酶吗？
接着做。 我就不信筛1000个没有一个对的。 |
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x**e
发帖数: 163 | 22 正在做一个植物的cDNA文库构建，用的clontech的smarter infusion试剂盒，但是发现
infusion的效率极低，不知各位有没有用过这个试剂盒的经验？
另，后改用sfiI双酶切，企图连接到载体上，发现cDNA上的sfiI切点似乎也切不开，
sfiI位点序列是正确的，上到T载体上后仍然切不开。求问可能原因及如何解决？
有没有更合适的建库方法？
谢谢！ |
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s*******y
发帖数: 2366 | 23 那就一个一个切
看看链的起来不
你ligate的时候没做self ligate的control吗？
惭愧。我是postdoc，实验室里就我一个人做分生。
双酶切， SacI和SalI，没有CIP处理。
这种情况下3：1链接过夜没问题吧？
只是想问问版上是否自己的设计本身就不合理。
主要是另外7个小的都出来了，这三个耽搁太久了。有些急。 |
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A*******e
发帖数: 284 | 24 我也一直觉得自己没有真正搞清楚这个连接比例的问题，正常的情况下比较好做克隆也
就不顾这些了，但碰到一些极端情况，如极大或极小的insert，就觉得难了。假若我不
告诉你那个是载体，那个是片段，告诉你需要将两个DNA分子连接起来，该取什么样的
摩尔比。
单梅切若载体不去磷酸化，基本没有成功的可能。最好双酶切的策略。这种8kb的片段
比较大，很难克隆的。 另外我觉得产物纯度很重要，尤其是胶回收的产物，每次测得
时候总发现260/230的比例不够理想，所以觉得这种回收产物最好不要加太多到连接体
系里面。实际上我也发现胶回收的片段加多了就会连接不好 |
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s*f
发帖数: 1071 | 25 特朗普显然是生长激素奶喝多了，才会变得这么脑残易怒。
不少独立科学家警告孟山都，rBGH激素增加了IGF-1因子的水平，有可能会导致人患上
癌症。被公认为致癌物质研究权威的美国伊利诺伊州立大学公共卫生学院的萨缪尔·爱
泼斯坦博士就曾警告说，越来越多的科学依据表明，IGF-1因子与人类癌症的产生有很
大关联，而且这种癌细胞可以在体内潜伏多年。
美国奶农们报告说他们的奶牛寿命平均缩短了，并且奶牛患上了严重的蹄和乳房传染病
。有人写了本书称，自从美国奶牛用了生长激素，它们的乳房就变得十分巨大，“几乎
拖到了地面”，牛奶的产量最多可以增加10倍！更可怕的是，自从Posilac上市后，美
国女孩子的胸部就持续变大，来月经的年龄也提前了。
孟山都公司称之为rBGH或 rBST的转基因牛生长素造成严重的健康问题。特别是，服用
这种生长素的牛的牛奶中，称之为IGF-1的一种作用很强的荷尔蒙显著增加。美国癌症
防治联盟主席塞缪尔·爱泼斯坦告诉我们， IGF-1与“乳房癌、结肠癌、前列腺癌”有
关的研究有大约60项
在国际上，加拿大、澳大利亚、新西兰、日本、以色列和欧盟27个国家明令禁用rBST。
为获得... 阅读全帖 |
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y******y
发帖数: 107 | 26 用shirmp alkaline phosphatase 处理过双酶切plasmid A. 不知道为什么colony这么
少。 |
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X***n
发帖数: 366 | 27 惭愧。我是postdoc，实验室里就我一个人做分生。
双酶切， SacI和SalI，没有CIP处理。
这种情况下3：1链接过夜没问题吧？
只是想问问版上是否自己的设计本身就不合理。
主要是另外7个小的都出来了，这三个耽搁太久了。有些急。 |
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A*******e
发帖数: 284 | 28 我大约在200ul体系里面加了几十ug的质粒，按理不算多了。
我也这么想的，在中间克隆一个2-3kb的片断进去，再利用分子量的差异回收。理论上
可行，但实际操作上还有困难，因为没有切开的质粒电泳是不按线性质粒规律的，跑得
要快一点，说不定也就赶上切开的质粒了 |
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s******y
发帖数: 28562 | 29 I think the empty plasmid from your negative control cells are actually due
to self-ligation.
You may need to treat your cutted plasmid with Alkaline Phosphatase for 5~10
minutes right after digestion and then recover the cutted produt on agarose
. |
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m*********7
发帖数: 5207 | 30 In principle, two different sticky ends should not self ligate.
in reality, it happens all the time!
I still don't understand why after so many years, and I keep using
phosphatase under that circumstances. |
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s********n
发帖数: 2939 | 31 以前只是做克隆，怎么折腾总能出要的东东。但现在做库的话就需要十分小心，我的制
备的vector几乎没有background，但链接效率不高，最终只能拿到1E7/ug vector。希
望能介绍一些提高链接效率的方法。 |
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n***e
发帖数: 180 | 32 回收试一下fermentas的glass beads based DNA purification，大概回收率在8成左右
，qiagen的应该在5成以下 |
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d*********n
发帖数: 10 | 33 强烈建议用 MO BIO Laboratories, Inc的UltraClean DNA purification Kit (Cat #
= 12100-300). 自从我摒弃QIAGEN的Kit,改用MO BIO的Kit以后，胶回收片段的回收率
一直很高很稳定(很强大)。我们实验室现在都在用这个KIT.
GOOD LUCK! |
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s********n
发帖数: 2939 | 34 你建议的这个kit不是spin column的，这个公司的spin column的产品如何？
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C*******e
发帖数: 4348 | 35 我推荐的ZymoResearch的是spin column |
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A*******e
发帖数: 284 | 36 我已经定到了这个公司的kit，正想试试，谢谢啦！
另外请问用过他们的plasmid kit吗？ mini的或max的，好用吗？
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b****u
发帖数: 903 | 38 ME too, 最近亚克隆都邪门了，链接的板上一个不长或者很少几个，而vector自连的长
了几十个，用的是neb的ecor1和sal1双酶切。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 39 PCR screen的都是positive的……
噢，送出去测序了，另外只好重新来了，刚到一个实验室，感觉所有系统都还不熟悉。
以前这种连接三天就搞定了 |
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s********n
发帖数: 2939 | 41 可能个人偏好不同，PCR优点在于通量高，而且很大提高正确率，自从以前做的一个低
效率克隆（1/20）后我就都改用PCR screening了。 |
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i*****i
发帖数: 30 | 42 首先问楼主
1.PCR出来有条带吗
2.是双酶切吗，单salI必须去磷酸化，引物有保护碱基吗 |
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v***a
发帖数: 1242 | 43 PCR check看不到任何条带
是双酶切，用的另一个是MluI，引物前都各加了2个保护碱基
期待高见 |
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s********8
发帖数: 619 | 44 我的回收产物应该还是比较好的,260/230挺高,应该没有什么salt contamination.现在
已经pnk treat了纯化的PCR产物, 试一下3:1 blunt end 连接.如果不成功的话我就重
新订引物双酶切了.下次还是尽量不要做blunt end 克隆了. |
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H****N
发帖数: 997 | 45 heat your sample at 65 degree for 10 min, then load your sample. If it works
, i will tell you why. |
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h**********r
发帖数: 671 | 46 protein binds with DNA? I will try~~
If it works, baozi will be sent to you.
Thanks! |
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h**********r
发帖数: 671 | 47 是挺有改进的。请查收，5个包子。Thanks! |
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H****N
发帖数: 997 | 48 Some REs stick to the DNA after digestion, resulting in the smeared bands
with incorrect migration rates. Heating disrupts the interaction. Heating at
70 degrees could have worked better. I am glad it has worked. Thanks for
the BAOZI. |
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b******s
发帖数: 1089 | 49 smear很经常是由于你之前提质粒时不够干净，其中残留的DNase在你加了digestion
buffer后部分降解DNA，前面有人说heat到65度就是为了deactivate DNase。你也可以
用柱子纯化。
size不对不要心怀侥幸。肯定有问题。你还是去sequence一下为好。 |
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H****N
发帖数: 997 | 50 He/she digested the DNA first before heating to 65 degrees. Also, there is
no smear in the other digestions with different REs, which is clearly against
your argument about DNase. DNAse would make the fragments smaller, not bigger. |
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