a********e 发帖数: 3771 | 1 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: andyzzdlee (麦地之一看二慢三通过), 信区: Biology
标 题: western提蛋白的困惑:多次离心vortex会不会降解蛋白
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jan 20 23:38:17 2010, 美东)
最近一次做western,用NEPER kit提取胞浆里的ERK和p38蛋白。因为用划伤组织做刺激
,脱落不少细胞,我就把medium离心得到这些脱落的细胞。同时在培养皿里加冰PBS,
在冰PBS里刮下剩余的细胞放进脱落的细胞里再次离心。然后用kit里CER lysis buffer
裂解(已加入inhibitor cocktail)。
裂解的时候我vortex两次,每次15sec。NEPER protocol要求vortext一次,15sec即可。
结果照片洗出来什么都没有,连EGF刺激的positive control都没出来。
以前只用过一次NEPER,erk出来band,而且结果可信。不同点在于没有收集脱落的细胞。
所以我考虑是不是多次离心、vortex是蛋白降解,也可能是收集脱落细 |
a********e 发帖数: 3771 | 2 遇到点困难,知道这儿专家多,借宝地行个方便。明天就删。
如果有前辈愿意指教,能否去生物版回帖?
链接放在这儿:
http://www.mitbbs.com/article_t0/Biology/31314597.html
多谢! |
a********e 发帖数: 3771 | 3 谢谢!
第一条我也这么想,一抗应该会和蛋白结合。如果没有band,可能是带有结合位点的片
段跑出胶外了。
转膜以后的胶上面应该只有中高分子量的蛋白了吧,小分子蛋白剩余量大概有多少呢?
我没做过这个,进一步请教。 |
h******l 发帖数: 238 | 4 除非你的细胞里面有特别强的蛋白酶,否则不应该是降解的问题。
找个分子量近似的足量蛋白,用抗体blot一下看看阳性对照能出来不。 |
k*****e 发帖数: 372 | 5 样本问题:
1. 是不是全程直到上样前都在冰上呢?包括PBS,medium,lysis buffer
2. 为了避免化学试剂干扰,我一直用最原始的方法:注射器,去裂解细胞
跑胶:
如果前导的dye没有跑出去的话,应该小分子蛋白也不会跑出去的吧?如果真的太小,
下次留心,别让蓝色条带太靠底了。(个人觉得不像是这个问题)
转膜:
温度过高? |
m****a 发帖数: 287 | 6 You can get phosphatase inhibitor A and B in Santa Cruz! Works well!
Try low concentration of blocking buffer. |
a********e 发帖数: 3771 | 7 提取脱落细胞的时候medium可能不够冷,虽然tube都在-20度预冷1小时,取出后一直在
冰上。
前导dye我一般让它跑到边缘或者刚好跑出去,大概要跑65min。小分子蛋白我觉得暂不
考虑,如果是和一抗结合的位点在小分子蛋白上,而且还跑出来了,那真是小概率事件
了。
注射器裂解?怎么做?
【在 k*****e 的大作中提到】 : 样本问题: : 1. 是不是全程直到上样前都在冰上呢?包括PBS,medium,lysis buffer : 2. 为了避免化学试剂干扰,我一直用最原始的方法:注射器,去裂解细胞 : 跑胶: : 如果前导的dye没有跑出去的话,应该小分子蛋白也不会跑出去的吧?如果真的太小, : 下次留心,别让蓝色条带太靠底了。(个人觉得不像是这个问题) : 转膜: : 温度过高?
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a********e 发帖数: 3771 | 8 谢谢前辈回帖。
这次我煮沸时间比以前长,15min 95度。怕是这个原因造成降解。
【在 h******l 的大作中提到】 : 除非你的细胞里面有特别强的蛋白酶,否则不应该是降解的问题。 : 找个分子量近似的足量蛋白,用抗体blot一下看看阳性对照能出来不。
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a********e 发帖数: 3771 | 9 谢谢指点。
您说的是blocking buffer里的牛奶浓度吗?我用的是5%
我在dxy上看到几个回帖,说p38用BSA稀释比牛奶稀释一抗更容易作出来。
【在 m****a 的大作中提到】 : You can get phosphatase inhibitor A and B in Santa Cruz! Works well! : Try low concentration of blocking buffer.
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m****a 发帖数: 287 | 10 是的,不过我觉得跟抗体有关系。可以重新试试别的批号的。实在不行就用BSA。如果
还不行,就换整个提取的系统。我没煮过15min,不知道有何后果,觉得其他问题都不
大。这两个都算是强信号,tissue里面酶比较多,有时候相对不好做。 |
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a********e 发帖数: 3771 | 11 好的,暂时排除vortext和多次离心。
我下次实验尽量缩短提取时间,全部冰上低温操作。换BSA稀释抗体。
【在 m****a 的大作中提到】 : 是的,不过我觉得跟抗体有关系。可以重新试试别的批号的。实在不行就用BSA。如果 : 还不行,就换整个提取的系统。我没煮过15min,不知道有何后果,觉得其他问题都不 : 大。这两个都算是强信号,tissue里面酶比较多,有时候相对不好做。
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p********g 发帖数: 372 | 12 如果你阳性对照都没有Band的话,很可能是Gel Transfer的问题,检查Transfer
buffer.Sandwich you made, current......Transfer以后,你可以兰染一下胶,看看
有多少蛋白transfer了。另外,如果你用Rainbow molecular weight marker, after
transfer, you can see the rainbow band in your PVDF or NC membrane. |
y*****t 发帖数: 264 | 13 1 visible molecular weight marker can exclude the possibility caused by gel
trasfer
2 how is the internal control? beta-actin or others ( for phospholated
protein, it is different internal control) ? if it is there, you can exclude
the possible problem caused by enzyme digestion.
3 If you can't find the band of internal control, then add extra inhibitor
cocktail may be necessary .Sigma has kit ready to go. |
k*****e 发帖数: 372 | 14
就是加入Histidine-sucrose buffer, 然后把细胞刮下来,用细针的注射器抽吸,来回
7-10次即可。细胞过细针头时机械性挤破了
【在 a********e 的大作中提到】 : 提取脱落细胞的时候medium可能不够冷,虽然tube都在-20度预冷1小时,取出后一直在 : 冰上。 : 前导dye我一般让它跑到边缘或者刚好跑出去,大概要跑65min。小分子蛋白我觉得暂不 : 考虑,如果是和一抗结合的位点在小分子蛋白上,而且还跑出来了,那真是小概率事件 : 了。 : 注射器裂解?怎么做?
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k**e 发帖数: 2728 | 15 why dont you add lysis buffer directly into the wells, instead of rinsing ce
lls off the plate with PBS? you can pre-rinse cells with ice cold PBS to mak
e sure they are cold (on ice the whole time), and aspirate off the PBS buffe
r completely, then directly add lysis buffer into the well, and scrape every
thing off with cell scrapers, then collect everything into the tubes. to ext
ract proteins, sit on ice for 10 min then shake for 30 min before spinning d
own for 10 min. the sup will be the ex
【在 a********e 的大作中提到】 : 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】 : 发信人: andyzzdlee (麦地之一看二慢三通过), 信区: Biology : 标 题: western提蛋白的困惑:多次离心vortex会不会降解蛋白 : 发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jan 20 23:38:17 2010, 美东) : 最近一次做western,用NEPER kit提取胞浆里的ERK和p38蛋白。因为用划伤组织做刺激 : ,脱落不少细胞,我就把medium离心得到这些脱落的细胞。同时在培养皿里加冰PBS, : 在冰PBS里刮下剩余的细胞放进脱落的细胞里再次离心。然后用kit里CER lysis buffer : 裂解(已加入inhibitor cocktail)。 : 裂解的时候我vortex两次,每次15sec。NEPER protocol要求vortext一次,15sec即可。 : 结果照片洗出来什么都没有,连EGF刺激的positive control都没出来。
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k**e 发帖数: 2728 | 16 wow... thats way too long.
5 min 95C, the maxium.
i know some lab even do 50C, but of course for longer time.
【在 a********e 的大作中提到】 : 谢谢前辈回帖。 : 这次我煮沸时间比以前长,15min 95度。怕是这个原因造成降解。
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s*******w 发帖数: 1879 | 17 你vortex的速度多少?你第一次离心取沉积的时候会不会细胞已经裂解了?
还有你煮95度15分钟看到什么变化没有?沉淀有么?会不会你要的蛋白全部变性聚集了
压根跑不进胶里去(我干过一次这事)。。。 |