r**x
发帖数: 408 | 1 比方说有一个荧光分子，激发波长500nm发射波长550nm,将其标记在一个载体上之后，
这个载体在此激发波长处的散射强度太大了，把荧光的峰都遮盖住了，想问问各位高人
有没有什么办法能避免这个问题呢？我试了在比较短的波长处激发，比方说450nm，散
射峰还是很强以至于荧光的发射峰基本都看不见了。 |
f*******e
发帖数: 628 | 2 不明白你的问题。散射应该不会改变波长，荧光 filter 用的没错的话，荧光发射光对
比激发有波长变化，不会和散射有冲突。
用 450 即使可以激发，也不会改变荧光发射光谱波长，反而效率不高，更容易被遮盖。
散射有方向的话，可以避开散射强的方向测荧光。
【在 r**x 的大作中提到】
: 比方说有一个荧光分子，激发波长500nm发射波长550nm,将其标记在一个载体上之后，
: 这个载体在此激发波长处的散射强度太大了，把荧光的峰都遮盖住了，想问问各位高人
: 有没有什么办法能避免这个问题呢？我试了在比较短的波长处激发，比方说450nm，散
: 射峰还是很强以至于荧光的发射峰基本都看不见了。
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r**x
发帖数: 408 | 3 谢ls，这样说吧，比方说我的荧光分子激发波长是500nm，发射波长550nm，我在500nm
激发的时候，会得到500nm处的瑞利散射峰，由于我的载体比较大，导致这个散射峰非
常宽非常高，基本上覆盖了350-650nm,这样我就得不到荧光的真实值，因为你得到的是
散射和荧光叠加在一起的值，而且这个值主要是散射的。有啥办法可以扣除这个散射峰
强度吗？ |
f*******e
发帖数: 628 | 4 还是之前说的，用对 filter 就好。
荧光有 stokes shift, raleigh scattering 没有，靠波长分开应该没问题。简单的
optics.
除非你用的是没经过 filter 的广谱激发光，不然不太可能出现覆盖整个可见光谱没办
法去除的情况。
flow cytometry 都是两者同时测的。
500nm
【在 r**x 的大作中提到】
: 谢ls，这样说吧，比方说我的荧光分子激发波长是500nm，发射波长550nm，我在500nm
: 激发的时候，会得到500nm处的瑞利散射峰，由于我的载体比较大，导致这个散射峰非
: 常宽非常高，基本上覆盖了350-650nm,这样我就得不到荧光的真实值，因为你得到的是
: 散射和荧光叠加在一起的值，而且这个值主要是散射的。有啥办法可以扣除这个散射峰
: 强度吗？
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r**x
发帖数: 408 | 5 再谢，那FILTER是指荧光仪自带的FILTER还是需要再买其他的外置的？ |
K****l
发帖数: 861 | 6 不太懂的弱问一句：
如何确定350-650的散射峰不是发射峰？
500nm
【在 r**x 的大作中提到】
: 谢ls，这样说吧，比方说我的荧光分子激发波长是500nm，发射波长550nm，我在500nm
: 激发的时候，会得到500nm处的瑞利散射峰，由于我的载体比较大，导致这个散射峰非
: 常宽非常高，基本上覆盖了350-650nm,这样我就得不到荧光的真实值，因为你得到的是
: 散射和荧光叠加在一起的值，而且这个值主要是散射的。有啥办法可以扣除这个散射峰
: 强度吗？
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o****e
发帖数: 1011 | 7 longpass filter
【在 r**x 的大作中提到】
: 再谢，那FILTER是指荧光仪自带的FILTER还是需要再买其他的外置的？
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v*****s
发帖数: 20290 | 8 不好弄，你的这个散射峰其实已经未必是瑞利散射峰了。如果你光谱仪的入射角没有问
题，或者说真的在550nm有这个wing，那什么filter都滤不掉，因为本身频率就一样，
怎么滤？当然保险起见，先上至少两个530的ultra-steep long-pass filter再说，最
好是有两个notch filter。
比较有希望的办法是在入射样品之前，上narrow band-pass filter把你的laser line
好好滤滤。diode laser本身的频谱经常比较宽，你不注意看不出来，但是用来测弱荧
光和拉曼的时候很容易淹没信号。
或者就是数据处理的时候，想点办法，因为荧光应该是个相对比较窄的峰，散射峰的
wing是比较平缓的基线。
最后的办法就是换载体吧，搞不好你的载体本身有比较强的raman continuum或者
photoluminescence（不过那样的话，不太可能下延到350nm）。
500nm
【在 r**x 的大作中提到】
: 谢ls，这样说吧，比方说我的荧光分子激发波长是500nm，发射波长550nm，我在500nm
: 激发的时候，会得到500nm处的瑞利散射峰，由于我的载体比较大，导致这个散射峰非
: 常宽非常高，基本上覆盖了350-650nm,这样我就得不到荧光的真实值，因为你得到的是
: 散射和荧光叠加在一起的值，而且这个值主要是散射的。有啥办法可以扣除这个散射峰
: 强度吗？
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r**x
发帖数: 408 | 9 我这个载体是NONPOROUS SILICA,12nm，表面积200m2/g，上面生长了一些高分子，我先
后做了好几个样，都是在激发的时候，比方说500nm激发，瑞利散射的峰都超过了量程
（1000），但是荧光也才是不到100，我要是多LABEL一些荧光上去的话有用吗？ |
r**x
发帖数: 408 | 10 发射峰是个比较窄的峰，应该出现在它的发射波长处。
【在 K****l 的大作中提到】
: 不太懂的弱问一句：
: 如何确定350-650的散射峰不是发射峰？
:
: 500nm
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o****u
发帖数: 1299 | 11 try notch filter @500nm.
【在 r**x 的大作中提到】
: 比方说有一个荧光分子，激发波长500nm发射波长550nm,将其标记在一个载体上之后，
: 这个载体在此激发波长处的散射强度太大了，把荧光的峰都遮盖住了，想问问各位高人
: 有没有什么办法能避免这个问题呢？我试了在比较短的波长处激发，比方说450nm，散
: 射峰还是很强以至于荧光的发射峰基本都看不见了。
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m********3
发帖数: 2125 | 12 找stoke shift>150 nm, 发光效率高的荧光分子。 |
r**x
发帖数: 408 | 13 请问哪一家的NOTCH FILTER效果比较好啊？谢谢
【在 o****u 的大作中提到】
: try notch filter @500nm.
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r**x
发帖数: 408 | 14
【在 m********3 的大作中提到】
: 找stoke shift>150 nm, 发光效率高的荧光分子。
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r**x
发帖数: 408 | 15 有没有啥能和amine标记的荧光分子，STOCK SHIFT比较大的？我现在用alexa系列的，
STOCK SHIFT一般才十几二十的样子。
【在 m********3 的大作中提到】
: 找stoke shift>150 nm, 发光效率高的荧光分子。
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f*******e
发帖数: 628 | 16 alexa dyes r the best out there. when it comes to fluorescent dyes, you don'
t have much choice of stokes shift.
if you need that big Stokes shift for sure, quantum dots are your only hope.
but i don't believe it is the case in your initial problem.
check your fluoremeter setup. make sure you are using the correct settings
including illumination and filters.
【在 r**x 的大作中提到】
: 有没有啥能和amine标记的荧光分子，STOCK SHIFT比较大的？我现在用alexa系列的，
: STOCK SHIFT一般才十几二十的样子。
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p*l
发帖数: 1359 | 17 If your sample is highly scattering, you need to add filters. Filters only
work when the light is normal to the surface within +-5 degree. Make sure
your filters is located in the path where the light is collimated.
Semrock has good filters.
【在 r**x 的大作中提到】
: 我这个载体是NONPOROUS SILICA,12nm，表面积200m2/g，上面生长了一些高分子，我先
: 后做了好几个样，都是在激发的时候，比方说500nm激发，瑞利散射的峰都超过了量程
: （1000），但是荧光也才是不到100，我要是多LABEL一些荧光上去的话有用吗？
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m********3
发帖数: 2125 | 18 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D1199
Di-4-ANEPPS
there is a big stoke shift (150-200 nm).
【在 r**x 的大作中提到】
: 有没有啥能和amine标记的荧光分子，STOCK SHIFT比较大的？我现在用alexa系列的，
: STOCK SHIFT一般才十几二十的样子。
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r**x
发帖数: 408 | 19 这个LABEL起来不如那些succinimidyl ester方便啊，不明白是怎么LABEL上去的。 |
m********3
发帖数: 2125 | 20 这个有succinimidyl ester 版本的，不过不在市场上。
看下面的参考文献。
Neuron, Vol. 37, 85–97, January 9, 2003, Copyright 2003 by Cell
Press
你要的话需要跟corresponding author联系。
【在 r**x 的大作中提到】
: 这个LABEL起来不如那些succinimidyl ester方便啊，不明白是怎么LABEL上去的。
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