j*********g
发帖数: 463 | 1 想听听各位大神们的高见。
单细胞甲基化、单细胞ChIPseq是不是最有前景。但是也不是一般的实验室有条件做的。
最近看到一篇文章，用免疫荧光检测单细胞的特定基因组loci的组蛋白修饰。
原理很简单，就是结合原位DNA－ISH和PLA （proximity ligation assay）。组蛋白修
饰的抗体和一个特定基因启动子的biotin标记的DNA探针，如果结合的足够近（<40nm）
，用PLA标记的二抗可以检测到发光。
所需要的reagent大部分实验室应该都有，只需要去sigma买一个PLA二抗kit，克隆目的
基因的区域，用nick translation做一个生物素标记的探针。实验方法就是细胞染色，
不需要什么高超的实验技巧。
这个实验的好处是单细胞，观察特定的组织／细胞群，可能会得出跟ChIP－qPCR不同的
结论。缺点是不能定量、高通量。 |
s*********y
发帖数: 292 | 2 paper链接发来瞧瞧
你说的这个方法，可能对研究单个的、受转录调控的重要基因是很有用的（比如
p16INK4a locus）。
但是专门做表观遗传的实验室必定不会研究单个基因的调控，如果他们想讲个故事，说
某某修饰或者某某表观遗传的蛋白是重要的，必然需要一个全基因组水平的分析。至于
得出结论之后，再挑几个区域验证下，我觉得不是什么大问题
而且这技术细胞要固定的，只能看某个时间点。而做single cell的最好是能观察活细
胞 |
S**********e
发帖数: 620 | 3
的。
我非常不喜欢这个领域。
一类是灌水文，整一堆数据做分析，炒作概念，比如之前的Pol II Pausing, Super
Enhancer等等。发了无数的CNS，找到什么了？根本不知道怎么调控的，或者怎么调节
这些状态。
还有一类是利用表观遗传学的很多功能性的文章。到最后把机制做到各种表观遗传学的
变化就认为找到机制了。其实往往解释不下去了，找个转录调控来下台阶。这里头其实
表观遗传学的调控根本很有可能就是被动的。比如说表型A是因为表观遗传学的酶B活性
变化影响了靶基因C,D,E，但是这些酶B其实活性是非特异的，他们为什么找到CDE而不
是FGH...根本就不知道为什么。
单细胞是另外一个热点。很酷很强大，但是不找几百个细胞统计一下也没啥意义。统计
完了，估计也没什么新的发现。
【在 j*********g 的大作中提到】
: 想听听各位大神们的高见。
: 单细胞甲基化、单细胞ChIPseq是不是最有前景。但是也不是一般的实验室有条件做的。
: 最近看到一篇文章，用免疫荧光检测单细胞的特定基因组loci的组蛋白修饰。
: 原理很简单，就是结合原位DNA－ISH和PLA （proximity ligation assay）。组蛋白修
: 饰的抗体和一个特定基因启动子的biotin标记的DNA探针，如果结合的足够近（<40nm）
: ，用PLA标记的二抗可以检测到发光。
: 所需要的reagent大部分实验室应该都有，只需要去sigma买一个PLA二抗kit，克隆目的
: 基因的区域，用nick translation做一个生物素标记的探针。实验方法就是细胞染色，
: 不需要什么高超的实验技巧。
: 这个实验的好处是单细胞，观察特定的组织／细胞群，可能会得出跟ChIP－qPCR不同的
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t******k
发帖数: 599 | 4 那文章是几年前的了吧。貌似没有看到有其他实验继续用过这方法 |
j*********g
发帖数: 463 | 5 所以不靠谱？
[在 teekeetk (teekeetk) 的大作中提到：]
:那文章是几年前的了吧。貌似没有看到有其他实验继续用过这方法 |
t******k
发帖数: 599 | 6 这个就不知道了。。。
: 所以不靠谱？
: [在 teekeetk (teekeetk) 的大作中提到：]
: :那文章是几年前的了吧。貌似没有看到有其他实验继续用过这方法
【在 j*********g 的大作中提到】
: 所以不靠谱？
: [在 teekeetk (teekeetk) 的大作中提到：]
: :那文章是几年前的了吧。貌似没有看到有其他实验继续用过这方法
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i*********0
发帖数: 915 | 7 某华人表观遗传大牛不是说『表观遗传』是生命活动的总导演么，其他的诸如DNA，TF
啥的都是演员么。。。。 |
j*********g
发帖数: 463 | 8 表观遗传更多的是一种缓冲系统，fine-tuning。
[在 iseeyou1210 (iseeyou1210) 的大作中提到：]
:某华人表观遗传大牛不是说『表观遗传』是生命活动的总导演么，其他的诸如DNA，TF
:啥的都是演员么。。。。 |
R****n
发帖数: 708 | 9 能提供个文章或者详细说明么？我现在有个课题应该需要这个技术，多谢！
的。
【在 j*********g 的大作中提到】
: 想听听各位大神们的高见。
: 单细胞甲基化、单细胞ChIPseq是不是最有前景。但是也不是一般的实验室有条件做的。
: 最近看到一篇文章，用免疫荧光检测单细胞的特定基因组loci的组蛋白修饰。
: 原理很简单，就是结合原位DNA－ISH和PLA （proximity ligation assay）。组蛋白修
: 饰的抗体和一个特定基因启动子的biotin标记的DNA探针，如果结合的足够近（<40nm）
: ，用PLA标记的二抗可以检测到发光。
: 所需要的reagent大部分实验室应该都有，只需要去sigma买一个PLA二抗kit，克隆目的
: 基因的区域，用nick translation做一个生物素标记的探针。实验方法就是细胞染色，
: 不需要什么高超的实验技巧。
: 这个实验的好处是单细胞，观察特定的组织／细胞群，可能会得出跟ChIP－qPCR不同的
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i*********0
发帖数: 915 | 10 和miRNA一样么？
TF
【在 j*********g 的大作中提到】
: 表观遗传更多的是一种缓冲系统，fine-tuning。
: [在 iseeyou1210 (iseeyou1210) 的大作中提到：]
: :某华人表观遗传大牛不是说『表观遗传』是生命活动的总导演么，其他的诸如DNA，TF
: :啥的都是演员么。。。。
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R****n
发帖数: 708 | 11 昨天看了下ｐｒｏｔｏｃｏｌ,如果一抗不很好的花，不是有很多ｎｏｎｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ. |
j*********g
发帖数: 463 | 12 一来组蛋白抗体有很多很好的，尽量用验证过的，参考 http://www.histoneantibodies.com
二来得是组蛋白修饰一抗和你的probe同时存在才会发光；两者都不特异的概率很低，
使得非特异性大大下降。
【在 R****n 的大作中提到】
: 昨天看了下ｐｒｏｔｏｃｏｌ,如果一抗不很好的花，不是有很多ｎｏｎｓｐｅｃｉｆ
: ｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ.
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R****n
发帖数: 708 | 13 昨天定了duolink的kit,看看效果如何。
有没有biotin labelled DNA probe和一抗共染的比较好的protocol,有经验的ｓｈａｒ
ｅ一下吧
【在 j*********g 的大作中提到】
: 一来组蛋白抗体有很多很好的，尽量用验证过的，参考 http://www.histoneantibodies.com
: 二来得是组蛋白修饰一抗和你的probe同时存在才会发光；两者都不特异的概率很低，
: 使得非特异性大大下降。
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j*********g
发帖数: 463 | 14 文章里面的不行吗？
做成了，做不成，都记得来说说你的经验和教训哈。
【在 R****n 的大作中提到】
: 昨天定了duolink的kit,看看效果如何。
: 有没有biotin labelled DNA probe和一抗共染的比较好的protocol,有经验的ｓｈａｒ
: ｅ一下吧
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s*****g
发帖数: 7857 | 15 大家都买了啥kit了。说来听听
结果我也是静等花开。谢谢 |
s*****g
发帖数: 7857 | 16 另外，是否有验证两个细胞蛋白近距离接触的荧光显示kit?
细胞膜表面的信号通路起始蛋白间的吸引靠近。 |
g*********5
发帖数: 2533 | 17 https://www.youtube.com/watch?v=3N39R2as-84
【在 s*****g 的大作中提到】
: 另外，是否有验证两个细胞蛋白近距离接触的荧光显示kit?
: 细胞膜表面的信号通路起始蛋白间的吸引靠近。
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R****n
发帖数: 708 | 18 我quickly update一下，做了一个已知的DNA和histone modfication的组合（1个ctl,2
个KD），一次就成了。一抗用的是自己的buffer,二抗用公司的kit。信号非常强，都集
中在核内，这个和预期相符。其中一个KD，确实看到较少的foci.基本和下面这个一样。
https://www.youtube.com/watch?v=RFTbb5xd6iQ
有两个问题，
1）视频2：40时候，cover glass是用什么粘上去的？
2）我最后上mounting media的时候，有时候会有模模糊糊的一层影响DAPI的信号，但
是其他红光没影响，有时候同一批有的好有的不好。而且封片前都用水洗一下的，因为
有人告诉我是盐。肯定不是mounting media的问题，都是新的。
【在 j*********g 的大作中提到】
: 文章里面的不行吗？
: 做成了，做不成，都记得来说说你的经验和教训哈。
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