f*****n
发帖数: 499 | 1 小弟做某神经疾病关联位点的分子机理，已经做了的东西有：
1.首次发现这个相关位点，这个variants在某个基因的intron区域 （所以难研究诶）
2.把这个variants克隆进luciferase系统研究对表达的影响，有明显影响
3.我们有疾病相关的病人大脑组织样本，直接拿来进行eQTL的研究，但病人样本太
noisy所以结果不够significant，但trend和luciferase系统是一致的
4. 因为大脑样本结果不够明显，我也在用neuroblastoma的cell line做crispr，正在
等待结果
5. 同时合作者弄到了variants所在基因的knockout mice，正在等待结果看这个基因的
敲除是否对老鼠有影响
同时可能打算要做的：
6. 我通过public data计算发现这个variants所在区域可能binding的protein，所以打
算做chip－seq？
7. 最终极的还是直接在ips/stem cell里做crispr产生这个variants，然后诱导成我们
要的neuron。但是我对ips技术实在不懂又要从头学起。
老板是MD,所以思维跟我们phd完全不同。通过交谈我强烈感觉他好像对4（crispr）不
是很支持，但我其实都快做出来了，花了很多时间学技术。然后对6（chip－seq）这种
蛋白质－dna觉得不屑一顾。
他最看中对是5（老鼠），其次是3（大脑），这个也make sense。现在只能上帝保佑
knockout mice有好结果
我的问题是：
a。这里做crispr必要吗？我觉得必要，是因为这里2和3的证据完全不够强有力的证明
这个noncoding variants可以调控基因表达。连我自己都不够有信心，别说reviewer了
。但我就不懂为何老板不是很支持，是因为他觉得这里是neuroblastoma而不是真实的
病人神经元吗？
b。chip－seq的研究感觉大量越来越不屑一顾，因为binding不代表有功能。不知道我
说的是否正确？
c。关于ips的培养和转染以及一系列操作，到底有多难呢？neuroblastoma操作的很熟
练，ips上手快吗？
谢谢大家 |
l********e
发帖数: 415 | 2 Wild type allele conserved between mouse and human? |
S**********e
发帖数: 620 | 3
我觉得你老板的观点是合理的，跟MD或者PHD没关系，有了老鼠，其他都不是问题，相
反，你有别的没有老鼠，难上好杂志。
【在 f*****n 的大作中提到】
: 小弟做某神经疾病关联位点的分子机理，已经做了的东西有：
: 1.首次发现这个相关位点，这个variants在某个基因的intron区域 （所以难研究诶）
: 2.把这个variants克隆进luciferase系统研究对表达的影响，有明显影响
: 3.我们有疾病相关的病人大脑组织样本，直接拿来进行eQTL的研究，但病人样本太
: noisy所以结果不够significant，但trend和luciferase系统是一致的
: 4. 因为大脑样本结果不够明显，我也在用neuroblastoma的cell line做crispr，正在
: 等待结果
: 5. 同时合作者弄到了variants所在基因的knockout mice，正在等待结果看这个基因的
: 敲除是否对老鼠有影响
: 同时可能打算要做的：
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l********e
发帖数: 415 | |
l********e
发帖数: 415 | 5 4是一个好实验，可能可以锦上添花，但是那不是killer experiment |
l********e
发帖数: 415 | 6 关联分析只是correlation SNP只是marker 仔细想想这两点 就懂了 |
f*****n
发帖数: 499 | 7 No.
It's noncoding variants; but well-conserved in different primates
顺便扯一个题外话，大家都喜欢讲“conserved”，但是对于大脑／神经组织，人类在
很短都时间内从猿猴进化成人类，大脑是主要的改变区域，所以我觉得对于神经基因，
我们更应该关注fast－evolution的sequence，不知道这种想法是否有道理？
【在 l********e 的大作中提到】
: Wild type allele conserved between mouse and human?
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f*****n
发帖数: 499 | 8 是的。最重要的是5，如果结果这个基因knockout的确改变了疾病的phenotype，这一个
结果就可以引起领域里的关注了。但是：
第一，这个基因其实出现一段时间了，我和老板都很惊讶一直没有这个基因knockout
mice的结果报道，所以我强烈怀疑其他group也做了这个基因，但是结果不如意，所以
就一直没消息。
第二，这个noncoding variants虽然在这个基因内部，但是要知道不是说variant is
within the gene就说明这个variant一定调控这个基因本身。横跨几个megabase的long
－range调控其他基因的比比皆是。当然了，调控所在基因是所有正常人的第一反应，
是最大可能性的hypothesis
所以我个人是觉得首先要搞清楚noncoding variants到底在调控什么，所以我们去切了
大脑样本做eqtl，测量variants所在基因的表达量，但效果不太好，所以我现在对“这
个variant调控所在基因”这个结论不是非常自信和相信。而且eqtl本来就是个非常非
常noisy的实验，而且你都不知自己切的brain区域是否跟疾病有关系（不同区域功能不
同）。当然能有一堆brain sample就很不错了，也没得挑
这也是我为什么要做crispr的原因，做了crispr直接rna－seq，说不定是其他的基因表
达量发生了改变呢。这样我们确定了target以后一切就好说了。但是，感觉老板，以及
大部分人，大家好像都认定了，这个variant一定是调控所在基因，根据就是我的2里面
的那个傻傻的luciferase in vitro结果，就赶紧去做了mice knockout。。。。。。我
表示无语
第三，当然最最最最decent的实验，killer experiment，就是在病人ips里做crispr，
改变这个variant，再诱导成我们要的神经元。有了这个实验，其他都是鸡肋。所以我
在问，ips技术到底多难。。。毕竟neuroblastoma里纵然做成功，人家说这跟真实的
human primary neuron不同。。。
神经疾病，太难做。
【在 l********e 的大作中提到】
: 没有5和3，别的都是扯。你老板是正确的。
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f*****n
发帖数: 499 | 9 对。你说的很对。关键是我就是觉得我们发现了真正的cause，就是和snp marker关联
的真正的disease－causing sequence
所以除了eqtl，我们还需要test this hypothesis－－－这一段sequence是真正的病因
【在 l********e 的大作中提到】
: 关联分析只是correlation SNP只是marker 仔细想想这两点 就懂了
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