z*******9
发帖数: 112 | 1 有两个问题，想请教作Random Mutagenesis 的同仁，
1. 建完mutant library后，一般需要把bacteria涂板后，然后再把平板上所有的菌落
刮下，抽提DNA,
（这一步，我能不能偷懒，直接就把transformed的bacteria接种到液体培养基里，然
后直接抽最终的bacteria DNA。)
这个问题其实就是，为何建突变文库的最后为何一定要涂板培养？
2. 还有就是，这里的细胞scraper的头太硬了，每次刮菌落时都要把培养基刮下几块，
想问大家有没有推荐一个头较软的scraper，或者对刮菌落有什么建议，谢谢， |
Y*******n
发帖数: 15 | 2 不能偷懒， 转了Library的细菌克隆生长速度不一。如果在液体中培养， 你就相当于
在选择生长的快的某些克隆，这样的结果是你最终Library的Complexity/Completeness
会大打折扣，直接影响你接下来的Genetic Screen.
在平板上长出的每一个单菌落就是一个含有Tn Inserted Genomic Fragment的克隆，单
菌落越多， 你的Tn Insertion就越全面， 筛到东西的几率就越大。 |
z*******9
发帖数: 112 | 3 谢谢，
不知在刮菌落时，您有么有什么tricks，我刮的实在是慢，我是先加一点Buffer1，然
后再刮，有人也告诉我，先把菌落刮到集中，所谓的先干刮，然后再用buffer1冲下来
，我总是担心干刮会漏掉一些菌落，
（Buffer1就是Maxi抽提的Buffer1）
Completeness
【在 Y*******n 的大作中提到】
: 不能偷懒， 转了Library的细菌克隆生长速度不一。如果在液体中培养， 你就相当于
: 在选择生长的快的某些克隆，这样的结果是你最终Library的Complexity/Completeness
: 会大打折扣，直接影响你接下来的Genetic Screen.
: 在平板上长出的每一个单菌落就是一个含有Tn Inserted Genomic Fragment的克隆，单
: 菌落越多， 你的Tn Insertion就越全面， 筛到东西的几率就越大。
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z*h
发帖数: 773 | 4 Why do you need combine colony plasmids again as a library? Is it due to low
transformation efficiency? What strain do you use? For E. coli, B. subtilis
and yeast, your step is not necessary. |
l***y
发帖数: 638 | 5 平板上加点buffer或者medium泡一下，用个软软的小刷子刷，然后吸出来去离心就是
pellet
谢谢，
不知在刮菌落时，您有么有什么tricks，我刮的实在是慢，我是先加一点Buffer1，然
后再刮，有人也告诉我，先把菌落刮到集中，所谓的先干刮，然后再用buffer1冲下来
，我总是担心干刮会漏掉一些菌落，
（Buffer1就是Maxi抽提的Buffer1）
Completeness
【在 z*******9 的大作中提到】
: 谢谢，
: 不知在刮菌落时，您有么有什么tricks，我刮的实在是慢，我是先加一点Buffer1，然
: 后再刮，有人也告诉我，先把菌落刮到集中，所谓的先干刮，然后再用buffer1冲下来
: ，我总是担心干刮会漏掉一些菌落，
: （Buffer1就是Maxi抽提的Buffer1）
:
: Completeness
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s********n
发帖数: 2939 | 6 主要是cloning和expression不是同一个菌株
low
subtilis
【在 z*h 的大作中提到】
: Why do you need combine colony plasmids again as a library? Is it due to low
: transformation efficiency? What strain do you use? For E. coli, B. subtilis
: and yeast, your step is not necessary.
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s********n
发帖数: 2939 | 7 我自己是这样做的：如果要得到比较大的库，Spread在24x24cm的plate上，形成lawn，
加10 mL media or buffer，用转化涂板用的spreader轻轻洗下即可，如果洗不干净可
以再重复一次，然后离心形成pellet，提取质粒转化表达菌株。 |
j****n
发帖数: 3370 | 8 试过在表达菌株直接建库 library size不会比刮板子的低
刮板子方法虽然用的多，看着library size很大，其实重复的很多，biase很严重。当
然，没有方法是完美的
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.6
【在 s********n 的大作中提到】
: 主要是cloning和expression不是同一个菌株
:
: low
: subtilis
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