e***o
发帖数: 344 | 1 PCR扩增一个DNA片段.由于涉及2次酶切连接（建库测序用的）。这段DNA上带有4个NICK
。想了很多办法去补缺口。都没有成功。不知道各位大侠是否好的建议，用什么方法能
将这个DNA链上的4个NICK补齐，然后PCR.谢谢 |
l***y
发帖数: 638 | 2 每一段多大
怎么做出来的片段
试了点啥方法
信息给的越多别人才能帮你
NICK
【在 e***o 的大作中提到】
: PCR扩增一个DNA片段.由于涉及2次酶切连接（建库测序用的）。这段DNA上带有4个NICK
: 。想了很多办法去补缺口。都没有成功。不知道各位大侠是否好的建议，用什么方法能
: 将这个DNA链上的4个NICK补齐，然后PCR.谢谢
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e***o
发帖数: 344 | 3 切口的产生是因为建库的时候，需要连接一个linker，然后还要连接测序adapter. 为
了避免linker和adapter自连，linker以及连接测序的adapter没有磷酸化。由于切口两
端都是羟基，不能用连接酶连接，切口平移也失效（正义链的切刻和反义链的切刻会在
DNA链中间遇到而使链断裂）。
请各位指教！ |
l**********1
发帖数: 5204 | 4 Cas9?
if yes, try this link:
>http://zlab.mit.edu/assets/reprints/Ran_FA_Nat_Protoc_2013.pdf
【在 e***o 的大作中提到】
: 切口的产生是因为建库的时候，需要连接一个linker，然后还要连接测序adapter. 为
: 了避免linker和adapter自连，linker以及连接测序的adapter没有磷酸化。由于切口两
: 端都是羟基，不能用连接酶连接，切口平移也失效（正义链的切刻和反义链的切刻会在
: DNA链中间遇到而使链断裂）。
: 请各位指教！
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w******n
发帖数: 767 | 5 完全不需要补缺口，如果总长度在2k以内，用两端引物直接批就行了，大于2k,在中间
找个酶切位点再加一对引物。看看基因合成拼接，批不出来，换换酶。
NICK
【在 e***o 的大作中提到】
: PCR扩增一个DNA片段.由于涉及2次酶切连接（建库测序用的）。这段DNA上带有4个NICK
: 。想了很多办法去补缺口。都没有成功。不知道各位大侠是否好的建议，用什么方法能
: 将这个DNA链上的4个NICK补齐，然后PCR.谢谢
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p****t
发帖数: 18 | |
e***o
发帖数: 344 | 7 谢谢，这个应该可以work。我们也考虑过用这个但是这个会去掉末端的几个突触碱基。
我们的DNA很短，信息量会受到损耗。所以就放弃了。再次感谢！ |
